要旨
非糖尿病ラットおよびSTZ誘発糖尿病ラットの内分泌膵臓活性および組織学に硫酸バナジウム（VOSO4）を5および10 mg/kg、30日処理したときの影響を検討した． 糖尿病群では、血糖値は有意に上昇し、インスリン血症は顕著に減少した。 投与終了時、VOSO4は10 mg/Kgの用量で糖尿病群の血糖値を正常化し、インスリン血症を回復させ、インスリン感受性を有意に改善した。 また、VOSO4は非糖尿病ラットの膵島において、用量依存的にインスリン免疫陽性β細胞数を増加させた。 さらに、STZ-糖尿病群では、インスリン免疫陽性β細胞数の減少は、主にバナジウムの高用量でコントロールレベルに達するまで補正された。 したがって，VOSO4投与はSTZ実験糖尿病において血糖値およびインスリン値を正常化し，インスリン感受性を改善し，正常ラットおよび糖尿病ラットのβ細胞の増殖および/または再生を誘導した
1. はじめに
バナジウムは遷移金属の一つである。
バナジウム化合物は、消化管や呼吸器を経由して循環系に入った後、トランスフェリン、またはあまり一般的ではありませんが、アルブミンや血漿の低分子成分、例えばクエン酸塩や、より少ない程度ですが乳酸塩やリン酸塩によって輸送されます …。 無機および有機バナジウム誘導体について、糖尿病誘発動物モデルで多くの研究が行われ、研究化合物はグルコース、コレステロール、トリグリセリドのレベルに影響を与え、長期投与による大きな有害副作用はないことが判明している …
バナジウム（バナジルとバナデートを含む）は、糖新生、グルコースの取り込み、代謝を刺激し、肝グルコネシスとグリコーゲン分解によるグルコース生成を抑制することによって血糖値を下げることが示されている 。 バナジウムおよびバナジウム化合物は、インスリン受容体チロシンキナーゼ活性化およびキナーゼリン酸化カスケード経路を介してインスリン作用を模倣し、インスリン様活性を示すことが分かっている ……といった具合に、バナジウムおよびバナジウム化合物は、インスリン様活性を示すことが分かっている。 そのため、硫酸バナジルは1型糖尿病の治療薬として提案されている . ストレプトゾトシン（STZ）投与は膵臓のβインスリン産生細胞を破壊し、STZ誘発糖尿病ラットは1型糖尿病モデルとして考えられている。 バナジウム化合物はSTZ誘発糖尿病モデルにおいて抗糖尿病作用を示すことが知られているが、その作用機序は現在も検討中であった。 本研究の目的は、非糖尿病ラットおよびSTZ誘発糖尿病ラットに硫酸バナジウムを30日間投与したときの反応について検討することである。 Preparation of Diabetic Rats
動物は、0.01Mクエン酸緩衝液（pH4.5）中65mg/KgのSTZの単回投与による腹腔内注射（ip）により糖尿病にさせられた。 このip法は、STZ-糖尿病ラットにおける顕著なグルコース増加効果を示した最近の報告に基づいて選択された.
2.2. 動物および処置
雄のWistarラット、5-6週齢（体重175-200g）をチュニジアのPasteur Instituteから購入し、NIHの勧告に従った動物の使用およびケアに関するチュニス大学のローカル倫理委員会に準拠して使用された。 餌（標準ペレット食-Badr Utique-TN）と水を自由摂取させ、12時間明暗サイクルの収集温度（22℃）下でケージあたり5個を収容した。 ラットは6群に分けられた。
群1は非糖尿病対照動物（ND対照）で、毎日NaCl 9を腹腔内注射（ip）された。 第2群および第3群はNDで、VOSO4/Kgをそれぞれ5または10mg（ND＋5mg/KgおよびND＋10mg/Kg）、30日間連日投与した。 グループ4は、65mg/KgのSTZを単回投与した糖尿病コントロール（Dコントロール）であった。 グループ5および6は、それぞれ5または10mg／KgのVOSO4を30日間投与したSTZ糖尿病動物から成る（D＋5mg／Kg、D＋10mg／Kg）。 STZ群には、STZ誘発糖尿病の48時間後にVOSO4を投与した
2.3. 生化学的測定
すべての動物は、グルコメーター（ACCU-CHEK-Active Roche）による血糖値の測定の前に12時間絶食させた。 インスリン感受性は1U/Kgのインスリンをip注射した後に測定し、血糖値は2時間の間30分間隔で、.1486>
最後の治療から24時間後に動物を犠牲にし、血液を収集し、Elisaキット（BioVendorによって販売されている）によって決定されたインスリンの推定に処理された血清である。 免疫組織化学的評価
ランゲルハンス島のβ細胞の完全性を特徴付けるために、インスリンの免疫組織化学的染色を実施した。 このために、ランゲルハンス島の最大に大きい表面を示す組織切片が、群間の比較のために選択された。 切片はまず脱パラフィンし、徐々に減少するエタノール系列で水和し、クエン酸タンポン（pH 6）に40分間浸漬し、50 mM Tris-HCl, pH 7,6（DAKO) で希釈したポリクローナルギニアピッグ抗インスリン抗体とインキュベートした。 洗浄後、ホスファターゼ結合抗ギニアブタ抗体で切片をインキュベートし、TechMate 500機械でレべリングした。 最後に、切片をヘマトキシリン/エオシンで染色した。
ラットあたり10個の膵島を顕微鏡で調べ、インスリン陽性およびインスリン陰性の細胞の数をその核に番号を付けることによって数えた。 データはインスリン免疫陽性細胞の割合／各膵島の細胞総数として表した＜1486＞＜4407＞2． 統計解析＜7675＞＜754＞各群間の差の有意性は、一元配置分散分析（ANOVA）後、Tukeyの多重比較検定により評価し、値を有意水準とした。 結果＜516＞＜754＞VOSO4投与が非糖尿病（ND）および糖尿病（D）ラットの血糖値に及ぼす影響を図1に示した。 対照ND群では投与中、血糖値に大きな変化は見られなかった（図1（a））。 NDラットにVOSO4を5または10mg/Kgで投与しても、最初の10日間、血糖値に有意な変化は見られなかった。 しかし、血糖値は5 mg/Kg投与で投与終了時に有意に低下し、10 mg/Kg投与では15日から30日まで対照ND群に比べ有意に低下した。 30日目の血糖値低下は、対照群に比べ、5mg/Kgおよび10mg/Kgの用量でそれぞれ約8％および15％であった。 STZ投与群では、血糖値の顕著な上昇（対mg/dL）が認められ、糖尿病が発症していることが示唆された。 糖尿病グループ（D）にVOSO4を5mg/Kg投与すると、10日目から血糖値が有意に低下し、10mg/Kg投与すると5日目から血糖値が有意かつ徐々に低下して30日目に正常レベルに達した。 表1にVOSO4無投与時と投与後のND群およびD群のインスリン濃度を示す（図1（b））。 VOSO4を5 mg/Kg投与したNDラットはインスリン血症レベルに有意な変化を示さなかったが、10 mg/KgでコントロールND群に比べ顕著な増加が得られた（対μg/L）。 さらに、コントロールD群ではコントロールND群（対μg/L）に比べ、インスリン血症が著明に減少した。 D群にVOSO4を投与すると、用量依存的にインスリン血症が著明に増加した。 1486＞＜754＞正常および糖尿病治療動物にインスリン（1U/Kg）をip投与したときのインスリン感受性の変化を図2に示す． NDラットでは、VOSO4 10mgまたは5mgで処理しても、インスリン投与に応じた血糖プロファイルは変化しなかった（図2（a））。 実際、これらの群では、インスリンの最大血糖降下効果は、それぞれ60分および90分までに観察され、初期血糖値の程度であった。 VOSO4の低用量で治療した糖尿病動物は、コントロールのD群と同様の血糖プロファイルを示し、60分までに最大値を減少させたが、高用量で治療したものは、インスリン注射後30分までに血糖値の有意（）かつ急速な最大値の減少を示した（図2（b））。 統計解析の結果、VOSO4処理によりインスリン免疫陽性細胞数がND＋5mg/Kg群で約20％、ND＋10mg/Kg群で約27％顕著に増加した（図5）。 VOSO4投与により、STZ糖尿病群のインスリン免疫陽性細胞数は、5 mg/Kg投与で12%、10 mg/Kg投与で23%と用量依存的に有意に増加した（Figure 5）。 STZ-糖尿病治療群とND対照ラットの比較では、有意差は認められなかった。
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)の順で投与した。
STZ-由来の膵臓ランゲルハンス島β細胞におけるインスリンの免疫組織化学的染色結果糖尿病ラット。 STZ-糖尿病治療ラットでは、非治療のSTZ-糖尿病ラットに比べ、より多くのインスリン免疫陽性細胞が存在することに注意。 対照D（a）、VOSO4 5 mg/Kgで処理したD（b）、VOSO4 10 mg/Kgで処理したD（c）。 ラット1匹につき10個の膵島を分析した。 スケールバー。 50 μm.
Effect of vanadyl sulfate on number of beta cells in %.VOSO4,
我々はバナジウムの抗糖尿病性について、血糖値、インスリン値および膵内分泌B細胞への影響を調べることにより検討した。
STZ誘発糖尿病ラットを用いて、硫酸バナジウム（VOSO4）を5および10mg/Kgで投与すると、無処置の対照群と比較して、それぞれ10日目および5日目の平均血糖値を有意に低下させることが示された。 30日目には、高用量の化合物を投与した糖尿病ラットは、ND対照動物と同様の血糖値を示した。 しかし、NDラットでは、VOSO4の低用量投与では血糖値に有意な変化は見られなかったが、高用量投与では投与15日目までに血糖値はほとんど減少せず、30日目には血糖値は約14%低下した。 この結果は、STZ誘発糖尿病動物、遺伝性糖尿病動物、栄養性糖尿病動物にバナジウム化合物を経口投与すると高血糖が有意に改善することを示した過去のデータと一致する。 また、Soveidらは1型糖尿病患者を対象に硫酸バナジウムを30ヶ月間経口投与し、インスリン必要量および血糖値を低下させ、その安全性と有効性を報告した
我々の研究でも、VOSO4の血糖降下作用は、糖尿病グループにおいて用量依存的に基礎インスリン血症の著しい増加を伴うことが明らかになった。 10 mgの投与で糖尿病ラットのインスリン血症レベルはほぼ正常化した。 特にバナジウム化合物を投与した糖尿病ラットの血糖値の低下は、血漿インスリン濃度の上昇と関連している可能性がある。 これらの結果は、バナジウム化合物の糖尿病状態の改善効果に関する過去のデータと一致した。
さらに、糖尿病および非糖尿病ラットのインスリン感受性に対するバナジウム投与の効果を調査した。 ND群ではホルモン導入後60～90分でインスリンの血糖降下作用が最大となることを示した。 しかし、D群では、VOSO4 を 10 mg 投与すると、ホルモン注入後の血糖値がより迅速かつ顕著に低下し、インスリン感受性が向上したが、5 mg 投与では D ラットの血糖反応に大きな変化はなかった。 VOSO4によるインスリン感受性の向上は、バナジウムが様々な組織において強力なインスリン模倣薬またはインスリン栄養薬として考慮できることを示す多くの研究と一致する。
バナジウム化合物は、血糖値の低下をもたらす複数の作用経路によって特徴づけられることが明らかにされている。 In vivoおよびin vitroの研究では、硫酸バナジルが骨格筋、肝臓、脂肪組織でグルコースの輸送と代謝を増加させることが報告されている。 バナジウム有機誘導体は、オルトリン酸アニオンと構造が似ているため、タンパク質のホスホチロシンホスファターゼを阻害する。 また、インスリン抵抗性を引き起こすインスリン受容体の脱リン酸化を担う酵素、PTP-1Bの活性を阻害する。 バナジウム化合物による血糖値低下のもう一つのメカニズムは、PKB/Aktキナーゼを活性化し、GLUT4トランスポーターによるグルコースの取り込みを増加させることである … 続きを読む PKB/Aktの活性化はGSK3のリン酸化も刺激し、その結果グリコーゲン合成が促進される。 一方、C-jun N-terminalキナーゼを阻害すると、実験的糖尿病におけるインスリン感受性が改善することがわかった。
バナジウムはグルコースの輸送と酸化、インスリン受容体チロシンキナーゼ活性を高め、インスリン依存またはインスリン非依存の生化学経路によってグルコースと脂質代謝にインスリン様作用を及ぼす 。
STZ投与により膵島のβ細胞が破壊され、インスリン依存性糖尿病が誘発されることはよく知られている． そこで、本研究では、糖尿病群では非糖尿病対照動物に比べ、膵島面積の減少に伴い、インスリンに対する免疫反応性β細胞数が顕著に減少することを明らかにした。 しかし、ND群およびD群では、VOSO4投与により、それぞれの対照群に比べ膵島が拡大した。 最も重要なことは、VOSO4投与により糖尿病ラットのインスリン免疫陽性β細胞数が用量依存的に増加し、糖尿病無処理群と区別されたことであり、VOSO4がSTZ誘発糖尿病ラットにおいてβ細胞を生成することが示唆されたことである。 実際、VOSO4 を 5 mg、10 mg 投与した糖尿病ラットの膵島におけるβ細胞数は、ND 群と比較して有意な差はなかった。 このことは、この化合物の膵臓インスリン分泌促進作用に関するこれまでの研究と一致する。 また、バナジウム投与により非糖尿病ラットの膵島でβ細胞数が有意に増加した。
マウス膵臓アロキサン灌流モデルにおいて、Waguriらは膵島外前駆細胞からβ細胞が再生する過程を報告している。 実際、STZ糖尿病ラットにおいて、VOSO4投与は膵島内分泌細胞からのβ細胞の増殖と膵島外前駆細胞からの分化を刺激する可能性がある。
以上のように、本研究は硫酸バナジルが糖尿病薬として有用であることを実証した。 しかし、現時点でのエビデンスはまだ限られており、ほとんどが動物モデルに基づいており、バナジウム化合物の治療用製剤や副作用についてはほとんど知られていないため、糖尿病患者に対する従来の治療法としての長期使用についてさらなる調査が必要である。
利益相反
著者らは、本論文の発表に関して利益相反がないことを宣言する。
謝辞
この研究は、チュニジア高等教育・科学研究省の支援を受けている。