要旨
本研究では、プロテオミクスを用いて亜鉛の肥満ラットの生殖能力改善作用のメカニズムを検討した。 3種類の異なる用量のZnSO4が精子形成とホルモン量に及ぼす影響を検討した。 精巣の精子形成はHE染色で観察した。 血清エストロゲンおよびテストステロン濃度は化学発光微粒子免疫測定法により測定した。 精子プロテオーム解析は液体クロマトグラフィー質量分析計で行った。 DAVIDデータベースを用いて、発現量の異なる遺伝子のGO濃縮解析とKEGGパスウェイ解析を行い、STRINGオンラインデータベースを用いて、PPIネットワークを構築した。 ZnSO4投与群では精子数、精子運動率、テストステロンホルモンが増加した。 ZnSO4は、肥満による精巣構造と精子形成異常を改善した。 プロテオーム解析の結果、ZnSO4投与群と肥満群の精子計6検体で、401個の発現量の異なるタンパク質が存在することがわかった。 差次的なタンパク質はDAVIDサイトに入力した。 次に、同定された341個のタンパク質を生物学的機能に従って分類した。 KEGG解析の結果、濃縮されたシグナル経路は、解糖/糖新生、炭素代謝、クエン酸サイクル、脂肪酸代謝、ピルビン酸代謝であることがわかった。 また、いくつかのタンパク質はバリン、ロイシン、イソロイシンの分解経路に関連していることが示された。 STRING解析により、36個のノードタンパク質が得られた。 Cytoscape解析により、これらのタンパク質は主に代謝過程、酸化還元、好気性呼吸、RNAスプライシング、グルタチオン抱合など9つのネットワークに関与していることが示された。 ZnSO4は代謝、炎症、精子成熟に関連するタンパク質発現を調節することにより、肥満雄ラットの生殖能力を向上させる可能性がある
1. はじめに
肥満は男性不妊症と関連している。 男性不妊率の上昇、精液の質の低下、肥満率の上昇には一定の時間的な整合性がある。 肥満は精巣の超微細構造の病理学的変化を引き起こし、造精細胞のアポトーシスが著しく増加する。 また、成熟精子数の減少は、肥満者の造精能の低下を招く原因の一つである可能性がある。 体内の微量元素代謝の乱れは、脂質代謝に相応の影響を及ぼす。 男性の生殖器系では、亜鉛イオンは主に精巣、精巣上体、前立腺、精液に分布しています。 亜鉛は前立腺機能のマーカーである。 さらに、精子機能を調節し、ほとんどの酵素反応の補因子として働き、精子の運動性を維持するのに役立っています。 また、亜鉛は精巣の発達と精子の形成に重要な役割を担っています 。 亜鉛の欠乏は、マウス精巣の生殖細胞のアポトーシスを著しく促進し、精子形成の停止と受精障害を引き起こします . 肥満の男性は正常体重の男性に比べ、3.5倍も乏精子症になりやすいという研究結果が出ています . 亜鉛の補給は、肥満の人の体重を減らすことができます。 血糖値（空腹時血糖値）、血中脂質パラメータ（総コレステロール、トリグリセリド値、高密度リポタンパク質コレステロール、低密度リポタンパク質コレステロール）、血圧は亜鉛の補給後に改善される . 亜鉛の経口製剤は精液中の亜鉛含有量を改善し，精子核タンパク質の変化（リジンからアルギニンへの変化）を促進し，精子核の早期解重合を抑制することができます． これは、明らかな副作用なしに、不妊患者の精子の運動性と精液の質を改善することができます . しかし、肥満の精子タンパク質に対するZnSO4治療の効果を理解するためのプロテオミクスの適用はまだ限られており、さらなる探求が必要である。
本研究では、肥満ラットの精子形成とホルモンレベルに対する3種類の用量のZnSO4の効果について調べた。 また、プロテオミクス解析により、この効果のメカニズムを解析した。 動物
7週齢のSprague Dawleyラット（体重180-200g）を河北医科大学実験動物センターから購入した。 ラットは12時間の明暗サイクルで、水と飼料を自由に摂取できる空調管理された部屋（温度、湿度、）で飼育された。 すべての動物実験手順は、河北省家族計画科学技術研究所の倫理委員会によって承認された
2.2. 肥満モデルの確立、動物のグループ分け、サンプリング
ラットをランダムに通常飼料群（各群15匹）と肥満モデル群（各群30匹）の2群に分けた。 各群に対応する飼料、すなわち通常飼料群には通常飼料を、肥満モデル群には高脂肪食を8週間与えた。 ラットの体重を毎週測定し、8週間記録した。 肥満モデル群の平均体重が対照群の1.2倍となったとき、肥満モデルは成功したとみなした。 ラットの体長（鼻先から肛門まで）を測定し、Lee indexを数式で算出した。 .
肥満モデル確立後、モデルラットをランダムに肥満群とZnSO4投与群の2群に分けた。 ZnSO4投与群のラットには、ZnSO4（天津永大化学試薬有限公司）（3.2mg/kg/日）を4週間経口投与した。 実験終了後、各群の体重、精巣重量、精巣上体重量、精巣周囲脂肪を測定し、腹部大動脈から採血を行った。 精子サンプルは尾側精巣上体から採取した。 精巣は摘出した。
2.3. Sperm Count and Sperm Motility
各ラットの左精巣上体を犠牲後直ちに採取し、1mLの温（37℃）生理食塩水の入ったチューブに移した。 その後、37℃で5分間振盪し、精子を分散させた。 希釈した精子懸濁液約10μLをヘモサイトメーターの各計数室に移し、精子濃度と運動率を測定した。 運動性は全精子中の運動性精子（a+b grade）の割合で測定した
2.4. 空腹時血清グルコース、血中脂質、インスリンの測定
血清中の総コレステロール、トリグリセリド、低密度リポ蛋白、高密度リポ蛋白の濃度はシーメンスケンタウルスXP分析装置で化学発光微粒子免疫測定キット（メディカルシステムバイオテクノロジー株式会社）により測定された。 空腹時血清グルコースは，ACCUTE TBA-40FR分析装置（東芝メディカルシステムズ株式会社，東京）を用いて，グルコース検出キット（メディカルシステムバイオテクノロジー株式会社，中国寧波市）により測定した． 血清中のインスリン濃度は、対応する試薬（Beckman Coulter, CA, USA）を用いてUniCel DxI 800システム（Beckman Coulter, CA, USA）で化学発光免疫測定法により測定した＜4166＞＜4251＞2.5． Enzyme-Linked Immunosorbent Assay（ELISA）＜8737＞＜1322＞レプチンレベルはELISAキット（Multisciences Biotech Co.Ltd.、Hangzhou、China）により測定した。 反応終了後、450nmで吸光度を読み取った
2.6. HE染色
精巣をBouin’s solutionで一晩固定した。 その後、精巣をアルコールで脱水し、パラフィンに包埋した。 試料は5μmの厚さで切片化し，HE染色を施した． 精巣の精子形成は光学顕微鏡で観察した
2.7. アンドロゲンホルモンの測定
Siemens Centaur XP analyzerで血清中のエストロゲンおよびテストステロン濃度を化学発光微粒子免疫測定法により測定した。 検出キットはSiemens Healthcare Diagnostic Inc.とCayman Chemical, Michigan, USAから購入した。
2.8. Liquid Chromatography-Mass Spectrometry
本研究で用いた精子タンパク質サンプルは、3群（正常群、肥満モデル群、ZnSO4処理群）のものである。 精子サンプルは尾側精巣上体から採取した。 8 M尿素、10 mM DTT、プロテアーゼインヒビターを含むライセートバッファーでタンパク質を抽出した。 超音波処理を3-5分間行った。 20000g、4℃で10分間遠心分離した後、上清を回収し、Bradford法でタンパク質を定量した。 抽出したタンパク質を100 mM TEABで100 μLにした後，200 mM TCEPとともに55℃で1時間インキュベートした。その後，375 mM ヨードアセトアミド（IAA）5 μLを添加した。 暗所で30分間インキュベートした後、予め冷却したアセトンを加え、-20℃で一晩インキュベートした。 8000g、10℃、10分間の遠心分離後、上清を注意深く除去し、ライセートを室温で2-3分間放置して乾燥させた。 最後に、タンパク質100μg、100mM TEAB溶液100μL、トリプシン酵素比タンパク質（1 : 50）を混合し、37℃で一晩酵素消化を行った。
液体クロマトグラフィー質量分析：部分消化したサンプルを取り、溶液A（2% ACN/98% H2O/0.1% FA）に溶解させた。 20000gで30分間遠心分離後、上清を取り、EASY-nLC liquid phase-Q Exactive質量分析計（米サーモフィッシャー社製）でタンパク質配列を検出した。
質量分析条件は、データ取得時間90分、スプレー電圧2kV、キャピラリー温度320℃、規格化衝突エネルギー27％、収集質量範囲300〜1400Daであった。 主要パラメータは、分解能：70000、AGCターゲット：36、最大IT：60ms、スペクトルデータ型：profile。 二次パラメータは、分解能17500、AGCターゲット54、最大IT80ms、アイソレーションウィンドウ3.0m/zであった。 Data Retrieval
MaxQuant 1.5.2.8 の検索エンジンで、第一の誤差は20ppm、第二の誤差は0.02Daです。 修正箇所は以下の通りです。 システインはCarbamidomethyl-Cysに修飾されており、可変修飾は以下の通りです。 Oxidation-M、LysisCまたはTrypsin、またはGlu-C消化。 酵素消化の場合、2箇所まで欠損が許容される。 データのギャップフィリング、正規化、差分スクリーニング()は、すべてPerseusソフトウェアの標準設定で行った。 両グループの6サンプルで合計1344個のタンパク質が同定され、定量された。 ZnとG群の差分タンパク質の質的・量的情報が得られた。 定量結果およびタンパク質の比率について、Perseusソフトウェアで検定および有意差分析を行った。 得られた差分タンパク質リストは以下の通りである：-test結果と差分分布解析結果から、合計401個の有意な差分タンパク質が得られた。 GO (Gene Ontology)とKEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) Analysis
Differential proteinをDAVID (Functional Annotation Bioinformatics Microarray Analysis) ウェブサイト（https://david.ncifcrf.gov/）に取り込み、バイオインフォーマティクスによる基本抽出を実施した。 DAVIDが提供するウェブツールを用いて、上記で同定したタンパク質に濃縮されている、細胞成分、分子機能、生物プロセスなどの機能アノテーション用語やパスウェイを検索した
2.11. タンパク質相互作用ネットワーク解析
スクリーニングした差分タンパク質をSTRING（https://string-db.org/）オンラインデータベースに取り込み、解析を行った。 差分遺伝子相互作用ネットワークマップが描かれた。 この相互作用ネットワークデータをCytoscape 3.2ソフトウェアにエクスポートし、ネットワークの中心ノードタンパク質を決定した
2.12. 統計解析
データは.NETで表示した。 統計解析はSPSS22.0で一元配置分散分析（ANOVA）を行い、値< 0.05を統計的に有意とした。 結果
3.1. ZnSO4処理後の精液パラメータとテストステロンホルモンレベルの変化
対照群と比較して、肥満群ラットの体重、精巣周囲脂肪、Lee指数、総コレステロール、トリグリセリド、高密度リポタンパク質、レプチン、ZnSO4処理群ラットのレプチンは有意に増加した。 対照群に比べ、肥満群ラットの低密度リポ蛋白質は有意に減少した。 肥満群に比べ、ZnSO4投与群では体重、精巣周囲脂肪、Lee指数が減少し、その差は統計的に有意であった（表1）。 ラットの生殖能力に対するZnSO4効果を検出するために、まず各グループの精液パラメータをWHO 2010基準に従って評価した 。 表2に示すように、肥満群では精子数および精子運動性が阻害された。 肥満グループと比較して、ZnSO4投与ラットの精子数および精子運動性は増加し、ZnSO4が肥満ラットの精液パラメータを改善することが示唆された。 肥満自体は血中脂質の増加を引き起こすが、今回の結果では血糖値、血中脂質、インスリン値は糖尿病のレベルには達していないことが示された。 糖尿病合併症の交絡因子が除外されたと考えることができる。 さらに、血清テストステロン値を検出しました。 その結果、ZnSO4投与群では、肥満群に比べ、テストステロンホルモンが増加していることがわかった（表2）。 このように、ZnSO4投与は肥満ラットの精液の質を改善することができた。
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3.2. ZnSO4投与は肥満による精巣障害の回復を改善する
続いて、精巣組織の組織学的分析を行い、その結果を図1に示した。 精巣組織学によると、正常群では正常な精子形成が見られたが（図1（a）、（d））、肥満群では精細管内腔がほとんど空になっており精子形成に乱れが見られた（図1（b）、（e））。 予想通り、ZnSO4投与群では、精巣組織学的に、正常なセルトリ細胞やライディッヒ細胞が出現し、精子形成も破綻しておらず、肥満群に比べ有意な改善が見られた（Figure 1(c) and 1(f)）。 したがって、ZnSO4は肥満による精巣構造と精子形成異常を改善することができる。
3.3. バイオインフォマティクスによる341種の精子タンパク質の分類。 細胞成分、分子機能、生物学的プロセス
発現量の異なるタンパク質を決定するために、プロテオーム解析を実施した。 ZnSO4投与群と肥満群の精子サンプル計6個で合計1344個のタンパク質を同定し、定量化した。 Perseusソフトウェアにより、タンパク質の定量結果および比率について、-testおよび差分有意性分析を行った。 その結果、合計401個の有意なタンパク質が得られた。 ZnSO4投与群と肥満群のタンパク質の機能差について、差分タンパク質をDAVIDサイトに入力した。 GO分類では、371個のタンパク質が解析され、30個のタンパク質が該当しなかった。 次に、同定された341個のタンパク質を生物学的機能に従って分類した。 DAVIDが提供するウェブツールを用いて、上記同定されたタンパク質に濃縮されている機能注釈用語とパスウェイを検索した。 これらの解析結果をFigure 2に示す。 との機能的注釈用語の濃縮解析では、細胞成分、分子機能、生物学的プロセスのオントロジーに注目した。
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
3.4. Zinc Effects Are Further Identified by Differentially Expressed Sperm Proteins
定量分析を行い、3群間のタンパク質レベルを比較した。 差分タンパク質では、代謝系、亜鉛輸送関連タンパク質、ネットワークのノードタンパク質を選択した（表3）。 統計的に有意な変化を示したタンパク質を図3に示した。 これらのタンパク質は、ARG2、COX5B、ZNT1、LYAR、およびTM165であった。 肥満群と比較して、ZnSO4投与群では、ARG2、COX5B、ZNT1の発現が有意に減少し、LYAR、TM165の発現が有意に増加した。
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STRING は既知のタンパク質間の相互作用を解析・予測するオンライン解析ソフトである。 STRINGソフトは、異なるデータ源に対応する重みをつけるスコアリング・メカニズムを確立し、最終的に総合スコアを与え、タンパク質-タンパク質相互作用のネットワーク・マップを構築している。 スクリーニングされた341の差分タンパク質をSTRING（http://string-db.org/）オンラインデータベースに取り込んで解析したところ、341のタンパク質が同定され、差分遺伝子相互作用ネットワークマップが作成された。 その後、この相互作用ネットワークデータをCytoscape 3.2ソフトウェアにエクスポートし、ネットワークの中心ノードタンパク質を決定した。 その結果、タンパク質組成の差によるネットワークは複雑であることがわかった（図4）。 次に、Cytoscapeプラグインを使用して、ネットワークのノードタンパク質を解析し、合計36個のノードタンパク質が得られた（表3）。 STRINGを用いて生成されたトップネットワークのリストから、サブネットワークを選択した。 Cytoscape解析の結果、これらのタンパク質は主に代謝プロセス、酸化還元、好気呼吸、RNAスプライシング、グルタチオン抱合など9つのネットワークに参加していた。
WHOは、異常または過剰な脂肪蓄積を持つ人を過体重または肥満と定義し、この状態は世界の人々の健康に対する増大する脅威を構成している 。 肥満の割合は急速に増加しており、病気のリスクを高めるだけでなく、並行して患者の生殖障害発症のリスクも高めているという報告もある。 世界的に男性の生殖機能が低下している中、肥満が精液の質を低下させることを認識する人が増えています。 BMIの上昇に伴い、精液のパラメータが変化し、精子の物理的および分子構造が変化します。 これまでの研究で、精子濃度および総運動精子数が高 BMI によって悪影響を受けることが判明している。 本研究では、肥満群のラットは正常体重群のラットと比較して精子濃度および精子の運動性が有意に低下したが、ZnSO4は肥満群と比較して精液パラメータを改善した。
性ホルモンの不均衡は男性の生殖に影響を与える可能性があり、過体重状態は男性のホルモンレベルに影響を与える可能性がある . 同時に、肥満は性ホルモンの異常などの内分泌疾患と密接に関係していることが研究で明らかになっています 。 男性の肥満は、ホルモンレベルの変化により、男性の生殖能に悪影響を及ぼします . そこで、各グループの血清レベルを検査した。 ZnSO4投与群では、正常群および肥満群に比べ、テストステロンホルモンが増加した。 ZnSO4処理により、アンドロゲンホルモンレベルが有意に上昇し、正常対照群レベルに一致したようです。 ZnSO4処理ラットの体重と血中脂質レベルの減少は、ライディッヒ細胞を修復し、その結果、テストステロンレベルを増加させる可能性があります。 結果として、機能的な男性の生殖システムは、精子形成と精巣構造の再生を支援し、再生することができます。 明らかに、ZnSO4投与群の精巣組織学は、セルトリ細胞とライディッヒ細胞が再生され、内腔の精子が回復し、改善されている。 したがって、大規模な比較プロテオミクスは、肥満群とZnSO4投与群との間のタンパク質発現の違いを明らかにするための有効なアプローチとなる。 本研究では、正常な受胎可能精子とZnSO4投与群の精子のタンパク質発現プロファイルの違いを明らかにした。
GOアノテーション解析により、24％のタンパク質が代謝プロセスに関連し、22％のタンパク質が触媒活性を持つタンパク質として分類されることが示された。 その他のタンパク質は、タンパク質結合、rRNA結合、酵素結合に分類され、ATP結合も含まれていた。 ATP結合タンパク質が生体内で基本的な役割を担っていることはよく知られており、合成過程や代謝過程の変化を示している。 ミトコンドリアは、細胞にエネルギー（ATP）を供給する小器官である。 また、ミトコンドリアは酸化ストレスの主要な標的でもある。 男性の体内では、ミトコンドリアは精子形成細胞の成熟過程における主要なエネルギープラントであり、射精後の精子にエネルギーを供給する役割も担っています。 そのため、肥満男性に酸化ストレスが生じると、精子中のミトコンドリアが大きくダメージを受ける可能性があります。 精子は酸化ストレスに弱く、ダメージを修復する能力に欠ける。 高脂肪食は肥満ラットに酸化ストレスを誘発し、精子ミトコンドリア膜の損傷を誘発し、ミトコンドリア機能に影響を与える . Egwurugwuらは、硫酸亜鉛は生理的投与量において、アンドロゲンと精子の質に対していくつかの有意な正の効果を有すると結論付けています。 しかし、高用量では有害であった。
ARG2 はミトコンドリア内に局在することが知られている。 また、プロリン、ヒドロキシプロリン、ポリアミンの前駆体であり、細胞増殖に不可欠なオルニチンの生成に重要な役割を担っています。 肥満とその関連疾患は、低レベルの慢性炎症によって特徴づけられる 。 ARG2 はマクロファージにおける炎症反応を促進し、動脈硬化や肥満に関連したインスリン抵抗性の証拠に寄与している . 我々は、初期の肥満がアルギナーゼのアップレギュレーションを引き起こし、アルギナーゼとアルギニン代謝産物の全身的な変化をもたらすと考える。 肥満群における ARG2 のアップレギュレーションは、肥満による細胞増殖や慢性炎症と関連している可能性があります。 アルギナーゼは、肝トリグリセリド代謝やミトコンドリア機能に関与する経路の活性化を抑制することにより、肥満による肝脂質異常や全身脂肪異常を改善する。
これらのタンパク質のうち、特にCOX5Bはミトコンドリア機能や細胞のエネルギー生産に関連し、高い関心を持たれている . シトクロム酸化酵素（COX、Complex IV）は、ミトコンドリア内膜に存在するミトコンドリア電子輸送系酵素で、その活性は下流のATP合成の原動力となるプロトン原子の生成に必要なものである … ミトコンドリア呼吸鎖の複合体IVであるチトクロム酸化酵素の3つのミトコンドリアアイソフォームのうちの1つであり、ミトコンドリア内膜に存在する。 COX5Bは、酸化的リン酸化の最終段階であるH2Oの生成と、ATPの生成に必要な電気化学的勾配の維持に関与している。 したがって、硫酸亜鉛投与ラットにおけるARG2とCOX5Bのレベルの低下は、肥満ラットの生殖能力、特に精巣再生、精子形成、精子運動性における亜鉛による影響を示唆していると考えられる。
本研究で同定された発現量の異なるいくつかのタンパク質は、亜鉛輸送プロセスに関与している。 例えば、Elgazarらは、ZnT1が支持細胞の細胞膜と細胞質に存在することを見出した。 研究では、Znt1が成体マウスの亜鉛のホメオスタシスに重要な役割を果たすことが示されている 。 金属応答性転写因子-1 (MTF-1) は、金属のホメオスタシスと酸化ストレスに対する細胞応答を調整する役割を担っています。 MTF-1 は亜鉛依存性の転写因子であり、亜鉛濃度の上昇に伴いメタロチオネインと亜鉛トランスポーター-1 (ZNT-1) 遺伝子を刺激する . Foster らは、亜鉛トランスポーター mRNA の相対的な発現が非常に多様であることを示した。 ZnT1 は精巣に最も多く存在し、細胞膜を介した亜鉛の輸送に相互作用している。 Noh らは、ZnT1 mRNA レベルが肥満女性でわずかに上昇していることを報告し、亜鉛トランスポーターの変化は、肥満に関連した炎症状態とも関連している可能性があるとした。
Ly1 antibody reactive homolog (LYAR) は、マウス T-cell leukemia line から分離された zinc finger protein をコードする cDNA として Su らによって初めて報告されました。 Lyar遺伝子は精巣に多く発現していることが知られており、LYAR型のC2HC亜鉛フィンガーモチーフと3つの核局在シグナルを含む核小体タンパク質をコードしている。 Leeらは、LYARタンパク質が精母細胞および精子細胞に存在するが、精子には存在しないことを見出した。 しかし、我々は精子において LYAR の発現を検出し、その発現は肥満ラットの精子では減少し、ZnSO4 投与群では増加した。 LYAR は、雄の生殖細胞や癌細胞で細胞質リボソームと結合し、核内でプレリボソーム RNA の処理に関与していることが確認された。 LYARは、哺乳類の男性生殖細胞やある種の腫瘍において、翻訳開始の2つの基本ステップのうちの1つを調節するものである。 LYARは、SLC7A11、HMOX1、CHAC1などの酸化ストレス遺伝子の転写をかなり抑制する。 Myc oncoproteinはLYARの遺伝子転写を活性化することでLYARの発現をアップレギュレートし、LYARのアップレギュレーションはCHAC1遺伝子発現を減少させることで酸化ストレスによるアポトーシスから癌細胞を保護する。 TM165は肝細胞癌で転写・翻訳ともに過剰発現しており、肝細胞癌の浸潤能に関連している。 しかし、最近の研究で得られたデータは、カルシウムとマンガンのホメオスタシスへの関与についていくつかの示唆を与えている。 TM165は、乳糖合成酵素や他の糖転移酵素の機能を維持するために、H+と引き換えにCa2+とMn2+をゴルジ複合体に供給している。 ヒトのゴルジ体タンパク質 TM165 は、酵母や細菌細胞においてカルシウムやマンガンを輸送することができる。 我々の研究では、肥満ラットのTM165の発現が減少し、亜鉛補給後に増加したことから、亜鉛補給後にTM165が増加することが示唆された
5. 結論
結論として、本研究の結果は、ZnSO4がホルモンレベル、精巣の再生、および生殖能力を改善する可能性があるという証拠を提供するものである。 プロテオーム解析ではさらに、ZnSO4は代謝、炎症、精子成熟、およびその他の相互作用に関連するタンパク質発現を調節することにより、肥満雄ラットの生殖能力を改善する可能性があることを示している。
Data Availability
この研究の結果を裏付けるために使用したデータは要求に応じて入手できる。
Conflicts of Interest
著者らは、本論文の出版に関して利益相反がないことを宣言する
Acknowledgements
この研究は、河北省政府基金臨床医学優秀人材育成・基礎研究プロジェクト（助成番号20170183）により支援を受けた
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