3.53.4.3 合成ファージ療法

ファージは、分子生物学、細菌遺伝学の発展において、制限酵素やリガーゼなどDNA分子の組み換えの初期ツールの提供など中心的役割を担っている。 この10年間、ファージ抵抗性機構の研究は、PCR以来、分子生物学にとって最も重要な技術の一つであるCRISPRヌクレアーゼシステムの発見につながった。 このような歴史的背景から、SBをファージに適用し、治療薬としての利用を完成させることは適切であると考えられる。 東欧ではファージ療法が一般化し、グルジアやポーランドなど、現在でもいくつかの有名な治療センターが存在する。 欧米では、初期に散発的な成功があったものの、抗生物質が広く普及するにつれて、ファージ療法は使われなくなった。 現在では、抗菌剤に耐性を持つ病原体、いわゆるESKAPE株48の台頭により、さらに幅広い病原体49が出現し、2050年までに癌よりも多くの死者を出すと予測されており、ファージ療法に再び関心が集まっている。

ファージの使用は抗生物質と比較していくつかの利点があり、主に特定の株を標的にして、それによって有益な微生物コミュニティをそのまま残すことができること、また、補完的なファージカクテルの使用、選択したホスト菌株に対するファージの「トレーニング」、または単に病原体に対する新しいファージの分離によって耐性を克服できることが挙げられます。 逆に、ファージ療法が信頼できる医薬品として欧米で広く採用されるためには、適切な対照を伴う強力な臨床試験、適切な宿主範囲を持つファージの同定時間の短縮、複雑なカクテルを必要としない標的株のファージ抵抗性や排除メカニズムの克服、ファージ粒子に対する望ましくない免疫反応の回避、抗生物質耐性遺伝子や細菌の病原性因子の一般化抑制などのハードルと改善すべき点がいくつかある。

ファージゲノムの高度なモジュール構成と、尾繊維、スパイク、尾管、キャプシドなどの機能モジュールとしてのファージ構造の組み立ては、ある意味でファージゲノムがすでにバイオブリックに編成されており、SBアプローチの理想的なターゲットとなっています。 将来の合成ファージ設計のための初期のテンプレートとして、糸状菌ファージPf3がマウスモデルで緑膿菌感染症を治療するために改変されました50。 Pf3の輸出タンパク質遺伝子は、制限酵素BglIIをコードする遺伝子に置き換えられました。その理由は、（1）この遺伝子置換によってPf3が複製不可能になり、封じ込め戦略を導入できること、（2）BglIIメチラーゼ遺伝子を持つ宿主でファージを安定的に増殖できること、（3）BglIIによって標的株のゲノムDNAで二本鎖切断が起こり、殺すことができるようになること、でした。 この研究の重要な発見は、感染マウスを工学的ファージPf3Rまたは溶菌ファージで処理すると、最小致死量3では同等の生存率が得られたが、最小致死量5ではPf3Rファージ療法で生存率が有意に向上したことであった。 血清サイトカインレベルの分析は、炎症反応の減少を示し、Pf3R治療グループのより良い結果は、溶解およびエンドトキシンの放出なしに標的株を効率的に殺したことに起因することを示唆した。 このファージがコードするCRISPR/Casシステムは、新しいスペーサーを獲得することができ、CAS3ヌクレアーゼは、宿主のビブリオコレラが自然免疫に用いる染色体要素に再度ターゲッティングされました。 この発見に続いて、Streptococcus pyogenesのII型CRISPRシステムをM13バクテリオファージに組み込み、大腸菌の抗生物質耐性および病原性遺伝子の配列を標的とするスペーサーを加えたものを、著者らはRNA-guided nucleases（RGN）と呼んでいる52。このシステムの優れた特異性を示すように、RGNはキノロン耐性をもたらすDNAジャイレースの一塩基多型を有する株を識別可能に殺すことができるようになった。 さらに、3つの細菌からなる人工コンソーシアムでは、他のコンソーシアムのメンバーを無傷のまま、選択した株を殺すことができた（コントロールに比べて400～20000倍の殺傷力）。 CRISPR/Casを介した殺傷の特異性により、ファージ療法は病原体を標的とするだけでなく、ヒトのマイクロバイオームを正確に調節することにまで拡大される可能性があります。 このようにファージは、病原体ごとに新たなプラットフォームを構築することなく、治療のために容易に展開することができる。 さらに、広い宿主範囲と、いくつかの抗生物質耐性遺伝子や病原性遺伝子を標的とするCRISPRアレイを組み合わせれば、病原体を特定する前に、推定的なファージ療法を行うことも可能になるであろう。 宿主域の拡大戦略には、ファージ受容体や必要な宿主因子を特定するための前方遺伝子スクリーニング53、細菌ゲノムからのプロファージ受容体結合タンパク質（RBP）配列のマイニング、合成ファージのリブート、例えば、HTS用の受容体結合タンパク質RBPライブラリーのコード化54、55などが含まれる。 カプセルによる受容体のマスキングは、バイオフィルムを分解するための外多糖加水分解酵素56やその他の酵素を発現させることで克服できる57。一方、他のマスキング機構や受容体発現の相異は、異なるRBPを含む複数の尾部繊維や非正規の高度保存細胞表面標的に対するRBPで操作されたファージによって克服することができる。 細菌は、制限修飾による自然免疫やCRISPR/CASによる適応免疫など、数多くの抗ファージシステムを展開しているが、逆にファージも、DNAに非正規のヌクレオチドを使用する、制限部位を少なくする、ゲノムを高メチル化して、制限酵素を阻害したり宿主のメチル化酵素を強化するタンパク質を送達するなど、これらのシステムを打ち破る戦略を複数進化させ、対抗してきたのである。

ここで述べた合成ファージプラットフォームは、規制当局の承認がより複雑になる可能性のあるファージカクテルの必要性を回避することができる。 ファージ工学の残りのターゲットは、免疫系の安定性や反応など、多くの生物製剤に共通するものである。 特に貪食細胞は、循環系からファージ粒子を除去する役割を担っている。 長期循環型ファージ変異体は、連続継代法58によって得られ、主要なキャプシドタンパク質に変異があることが判明した。 その後、同じくカプシドタンパク質の1つのアミノ酸の変化を直接遺伝子操作で導入したところ、ファージがマウスの循環系にとどまる能力が13000倍から16000倍増加した59。 治療薬としてのファージを改善するための他のパラメータ、たとえば生産、製剤、投与経路などは、おそらくSBの活動の範囲外であるが、ネイティブファージに関するこれまでの研究から得られた教訓は、SBで設計されたファージにも適用されるであろう。 100年以上前に始まったファージ療法の物語が、SB遺伝子組換えファージの臨床試験へと進むのは、次の記事で紹介するようになるだろう。