Intrinsic differences in study design

Most of recent rodent CR studies involved very young onset life-long CR initiated post-weeding, usually inbred genetic backgrounds.The early CR studies in the rodent lives of rses. 1980 年代になると、成体マウス（12 ヵ月齢）の CR も、若年発症モデルより程度は低いものの、老化を遅らせ寿命を延ばすのに有効であることが明らかになりました22。 多くのげっ歯類の CR 研究では、対照動物に自由摂取量を与える一方、肥満の交絡効果を回避し、 個体間の摂餌量のばらつきを少なくするため、自由摂取量より少ない量の餌を与える研究 も行われています。 1987年に開始されたNIAアカゲザルの研究では、CRの実施により対照サルに自由採食を行わないようにした。 成熟期の対照サルに過食させることなく、年齢と体重に応じたほぼ自由摂取量が得られるよう、全米研究会議が発表したデータに基づいて餌の割り当てが決定された23。 配給量は、身長が完全に伸びるまで、成長と発達を維持するために増量された。 CRサルは、身長・年齢・性別をマッチさせた対照サルに比べ、餌の量が30％少なかった。 介入は、雄の若年発症群と老年発症群、雌の若年・成人・老年発症群として開始された24 （表1）。 1989年に開始されたUW試験では、アカゲザルの身長が完全に伸びてから（約8歳）25、成体動物にのみCR食が開始された。 対照動物にはほぼアドリビタムの水準で食物が供給された。 コホート内の摂食行動の不均質性に対応するため、3～6 ヶ月間に測定したベースラインの食物摂取量を用いて各個体の自由摂取基準を設定し、個体単位で CR を実施した。

各コホートにおけるサルの出所と代表する集団タイプも2つの研究の違いのポイントであった。 UWのサルはWisconsin National Primate Research Centerで生まれ育ち、すべてインド系であった。 NIAのサルは数カ所から調達され、インドと中国の両方の起源のサルが含まれていました。 中国の雄のアカゲザルは、一般的にインドよりも重く、長く、雌はその逆で、中国のアカゲザルはより大きな性的二型を示すと考えられています26。 異なる起源のサルは、一塩基多型のパネルを使って区別できるほど遺伝的に異なっている27。 個体差は別として、アカゲザルはヒトと同程度の個体間遺伝的変異を有している28。 このように、個体の遺伝的異質性の寄与とは対照的に、2つの研究の結果の違いに対する集団の種類の寄与は、確認することが難しい。

食事組成も2つの研究の重要な違いであった。 まず、食事成分の供給元が異なっていた。 NIA施設では、季節変動の可能性があることを認識した上で、植物化学物質や微量ミネラルなどの微量栄養素が確実に供給されるよう、自然由来の飼料が採用された。 一方、カリフォルニア大学では、研究期間中、摂取量を完全に定義し、一貫性を持たせるために半精製飼料が採用された。 第二に、両地域の飼料はカロリー密度は同程度であったが、相対的な多量栄養素組成は同等ではなかった（表2）。 UWの食事と比較すると、NIAの食事は低脂肪、高タンパク質、高繊維質であった。 最後に、飼料に含まれる栄養成分にも違いがあった。 両地域の飼料には重量比で60%の炭水化物が含まれていたが、NIAではショ糖が全炭水化物の7%未満、UWでは45%であった。

給餌方法も研究間で異なっていた。 NIAでは、サルは毎日6:30と13:00の2食を与えられた。 朝の食事後に残った食物は約3時間後に取り除かれ、低カロリーのおやつ（通常は小さな果物の一片）が提供された。 午後の食事は除去されず、サルは夜間も食事にアクセスすることができた。 UWでは、すべてのサルに朝8時に餌を与え、16時に餌を取り去り、新鮮な果物や野菜のおやつを与え、素早く完食させた。 対照動物への餌の配分は、一日の終わりに必ず食べ残しの餌が取り除かれるように調整された。 このように、UWは日中自由摂取でありながら、夜間は餌を奪われることになる。 上記のように研究デザインにはかなりの違いがあるが、NIAとUWの霊長類施設では動物の収容と日常の動物看護は同等であったことに注目すべきである。 これには、飼育環境、温湿度範囲、照明サイクル、継続的に利用可能な水道水の使用が含まれる。 両研究とも、1日に数回動物のモニタリングを行い、指定された獣医スタッフが日常的に動物を検査し、必要に応じて優れたケアを提供した

生存に対するCRの影響

NIAとUWの両研究の最初の目標は、CRが長寿種に適切な介入であるという当然の結論ではなかったため、アカゲザルの健康への影響を調べることだった。 CRが長寿に与える影響の調査は、いずれの試験場でも主要なアウトカムとは見なされていなかった。 NIAの試験には121頭のサルが登録されたが、発症年齢が異なるため（1歳から23歳）、データ解析のために動物をグループ化することができなかった。 UW の研究では発症年齢の幅が小さく（7-15 歳）、1 群 38 頭（雌雄を含む）の近交系遺伝的に異なるサルのみであり、CR の長寿への影響を検証するために必要な統計的検出力があるとは思えなかった。 どちらの研究でも長寿のデータは報告されていないが、生存のデータは得られている。 飼育下のアカゲザルの場合、これまでに報告された生存期間の中央値は約26歳、10％生存率は約35歳、最大生存率は約40歳であった29。 死亡率曲線はUWとNIAで別々に作成された（Fig.1）。 両サイトのサルの生存推定値は、2015年7月までに捕獲したデータを基に、最も一般的な3つの統計手法を用いて算出した。 Kaplan-Meier積限界法、Cox比例ハザード回帰、ワイブル分布を仮定したパラメトリック生存分析です（表3）。 ワイブル分布は一般化極値分布の特殊なケースであるため、特に生き続ける動物による打ち切りデータがある場合、生存分布の上位分位数や最大寿命の推定に対応することができる30。

UW成人発症研究において、UWコントロール動物の推定生存率は、飼育下のサルの記録される平均（〜26歳）に近いものであることが判明した。 オスとメスを合わせて考えると、生存率を高めるCRの効果は統計的に有意であった（Cox回帰 P=0.017; 補足表1）。 ハザード比（HR）は1.865（95％信頼区間（CI）：1.119-3.108）で、どの時点でも対照サルはCR動物と比較して死亡率がほぼ2倍であったことが示された。 CR への反応に対する性別の影響は、統計的に有意ではなかった。 Kaplan-Meier解析では、生存期間中央値は雌雄ともに対照群より大きかった（表3）。 NIA の研究では、研究参加時のサルの年齢に大きな差があったため（表 1）、早期発症群 と後期発症群にデータを分離した。 本報告書では、NIAの雄の幼若および青年（J/A）と雌の幼若および成人（J/A）をグループ分けしている。 Kaplan-Meier 推定生存期間中央値は、雄または雌の J/A 発症群について、NIA 対照動物と CR 動物との間に差はなかった（図 1）。 Cox比例ハザード回帰では、J/A対照とCRの生存率の差は統計的に有意ではなかったが（補足表1）、CRサルは男女とも対照より早く80％の死亡率に達した。 NIAのJ/Aコホートの38％がまだ生存しているため、生存曲線は不完全であり、生存への影響はまだ確定していない。しかし、早期の死亡率は、個体によっては非常に若い時期にCRを実施することで生存リスクが生じる可能性があることを示唆している。 高齢発症のCRでは，Kaplan-Meier推定生存率は雄雌ともに対照群とCR群の間で差はなかったが（表3），生存推定値はJ/AサルおよびUW対照群のものよりも高かった． ノンパラメトリックKaplan-Meier推定法とパラメトリックWeibull推定法では、推定生存期間中央値に若干のずれがあったが、いずれの解析法でも研究施設間の生存率比較は一貫していた。 生存の結果にはある程度の性的二型が観察され、早期死亡の発生率は女性でより高いようであった。 この観察は、子宮の外側に子宮内膜組織が増殖する子宮内膜症によって部分的に説明されるかもしれない。 子宮内膜症は飼育下のサルでは比較的高い確率で発生し（約25％）、そのリスクは無産卵のメスでかなり高くなる31,32。 子宮内膜症の発生率は、対照群および対照群で同等であった。 NIAのJ/Aコホートでは、44人中12人が子宮内膜症による合併症で死亡し、このうち若年性発症の女性は非産婦であることが確認された。 一方、UW研究に採用された女性は、健康な乳児を少なくとも1人、3人以上産んでおり33、子宮内膜症による合併症で死亡した女性は30人中2人だけであった。 さらに、臨床症状の治療に関する方針も一因となっている。 UWでは、臨床症状を治療する方針が当初から実施されていた。 NIAでは、急性の痛みや苦痛は常に治療されていましたが、子宮内膜症を含む慢性的な病状はモニターされていましたが、医学的な治療は行われていませんでした。 子宮内膜症の発生率が高いため、2010年に方針転換が行われました。

Biometric and food intake measures from both studies

これらの研究の間、四半世紀以上にわたり、体重、身体組成、食物摂取量が197匹すべてのサルについて測定された。 体重は、絶食させ、麻酔をかけたサルで、年に2-4回、定期的な処置の際に測定された。 すべてのサルの縦断的データは、動物の年齢ごとに平均化された（Fig.2a）。 ヒトの場合と同様に、サルはしばしば悪液質または終末期の急激な体重減少を経験する。 食物摂取量や食事と無関係な体重変化の交絡を避けるため、各サルの生後最後の年のデータは除外した。 コホート間の比較を容易にするため、データは若年成人（11～13歳）、後期中年（18～20歳）、高齢者（25～27歳）を表す3つの年齢カテゴリーに分類された（補足表2および3）

獣医師は両研究地で年2回、サルの体調と健康全般を記録し、病気や障害の指標を特定した。 サルが最初に加齢関連疾患と診断された年齢を用いて、罹患率曲線を作成した（図6）。 加齢関連疾患には、がん、糖尿病、心血管疾患などの加齢性疾患に加え、サルコペニア、骨粗鬆症、関節炎、憩室症、白内障、持続性心雑音が含まれる。 Cox比例ハザード回帰モデリングにより、UWサルのCRと比較して、対照動物では約2.7倍の割合で加齢関連疾患が発生することが示された（HR: 2.665; CI: 1.527-4.653; P=0.0006）。 NIA J/Aコホートでは、CRと比較して対照動物では2倍の割合で加齢関連疾患が発生した（HR: 2.091; CI: 1.169-3.641; P=0.0125） (Supplementary Table 5; Supplementary Fig. 2)． 高齢発症のNIAサルの年齢が高いため、加齢に関連する疾患の初発を検出することはできなかった。