青、赤、緑の線はそれぞれバクトリアラクダの推定人口規模、ドメダリーおよびアルパカを表す。 中新世から完新世までの各ユニットの地質学的時間境界15を破線で示した。 中新世移行期（MPT）はオレンジ色で、南米の最終氷期最盛期（LGM）は青色で表示した。メシニアン期とザンクリーン期の時間境界（5.33Mya）15に近い37Myaと、アルパカの祖先がアメリカ大生物交換21でパナマ陸橋を通って南米に移動したウクイア期（3〜1.2Mya）の2.09Myaの間に、アルパカの祖先の有効個体数が徐々に減少したことがわかった。 このため、この移動がアルパカの祖先の個体数減少に寄与した可能性がある。 その後、更新世の間にその個体数は拡大し、501、139、44Kyaの3回にわたって大きなボトルネックの時期が続く。 その後、501年、139年、44年前に3回のボトルネックを経て、72年頃に大きな拡大が起こり、113×104個体の規模になった。 最も新しいボトルネック (44 Kya) は、南米で進行した最終氷期最盛期 (48-25 Kya) に相当し22、その結果、集団サイズは ~1.2 × 104 個にまで劇的に縮小した。 このことは、当時の南米の寒冷な環境が、更新世末期にアルパカの祖先の個体数を狭めた可能性を示唆している。

遺伝子進化

次に、環境適応の基盤となるラクダの遺伝子について検討した。 CAFÉ23を採用し、進化の過程で大きく拡大・縮小した遺伝子ファミリーを同定したところ（図2、補足方法）、ドロメダリーゲノムでは拡大した遺伝子ファミリーが373、縮小した遺伝子ファミリーが853、バクトリアンキャメルゲノムでは拡大した遺伝子ファミリー183、縮小した遺伝子ファミリー753、アルパカゲノムでは拡大した遺伝子ファミリー501、縮小した遺伝子ファミリー2，189が同定されました。 これら3種のラクダ科の拡大遺伝子ファミリーの多くは、細胞プロセス、細胞部分、嗅覚受容体活性、鉄、免疫関連のGene Ontology（GO）カテゴリーに著しく濃縮されている（補足図13〜15、補足表36〜38）。 バクテリオン・ラクダの287個の正選択遺伝子（PSG）（補足データ1）、ドロメダリーの324個のPSG（補足データ2）、両ゲノムに共通する151個のPSGを同定し、同様の選択圧であることが示された。 23種に存在するオーソログ遺伝子のユニークなアミノ酸残基の変化の評価では、バクテリオン・ラクダとドロメダリーでそれぞれ350と343の変化した遺伝子が同定された。 ラクダでユニークなアミノ酸残基の変化を持つ遺伝子のいくつかの過剰なカテゴリは、触媒活性、小分子結合、ATP結合に関連していた（補足図16、17、補足表39、40）。 シンテニックブロックの解析に基づき、バクテリオン・ラクダでは190個、ドロメダリーでは126個のゲイン遺伝子が同定された。 これらの獲得遺伝子は嗅覚と免疫関連のカテゴリーに有意に濃縮されている（補足表41、42、補足方法）。

エネルギーと脂肪代謝

食糧難の砂漠に住むラクダにとってエネルギーは重要なので、エネルギー関連プロセスに関わる遺伝子を選別して分析した。 ゲノムワイドに適応の特徴を系統別に加速進化を伴うGOカテゴリーで同定した（補足データ3-14）。 ウシとは対照的に、3つのラクダ科に共通して加速進化するGOカテゴリーは、インスリン刺激に対する細胞応答（GO:0032869、P<0.001）およびインスリン受容体シグナル伝達経路（GO:0008286、P<0.001）だった（補足データ4、8、および14）。 さらに、これらのラクダ科動物では、牛よりも急速に進化したエネルギー、グルコース、脂肪代謝に関連する多くのカテゴリーが同定された。 バクテリオン・ラクダでウシよりも急速に進化していると同定されたエネルギー関連のGOカテゴリーのいくつかは、以前に報告されたものと一致する3。 さらに、ミトコンドリア機能、β酸化、コレステロール合成・輸送に関わる13の遺伝子に、バクテリオン・キャメルとドロメダリーに特有のアミノ酸残基の変化が見られた。 バクトリアンキャメルのゲノムでは脂肪代謝に関わるいくつかの遺伝子（ACC2、DGKZ、GDPD4）が拡張されたが、ドロメダリーの拡張された遺伝子ファミリーはミトコンドリア（GO：0005739、P=2.30×10-5）のカテゴリーに富んでいた（補足表37）

これら3種のラクダのコブの数が異なることは脂肪代謝能力の違いからと思われた。 ATPに関連する機能カテゴリー（GO:0006200, GO:0016887, GO:0042626, P<0.01）、ミトコンドリア（GO：0005739, GO:0005759, P<0.01 ）、脂質輸送（GO：0006869, PBactrian camel=5.33 × 10-5, Pdromedary=0.00016) およびインスリン刺激に対する反応 (GO:0032868, PBactrian camel=0.0005, Pdromedary=1.33 × 10-5) はアルパカと比較してラクダの両種で急速に進化した（補足 表 43）。 脂質代謝に関連するカテゴリーは、ドロメダリーよりもバクトリアンキャメルで急速に進化し、例えば、脂質の異化過程（GO:0016042、P=0.0015）、脂肪細胞の分化（GO:0045444、P=2.54×10-9）（付表44）が挙げられます。 これらの遺伝子は砂漠でのラクダのエネルギー貯蔵・生産能力を高め、また脂肪代謝の違いを反映し、ひいてはこぶの数に関係している可能性がある。

ストレス応答

乾燥・高温環境に対する適応を調べるため、さらにストレス応答に関わる遺伝子を分析した。 ウシと比較して、DNA損傷・修復（GO:0006974, GO:0003684, GO:0006302, P<0.01）、アポトーシス（GO：0006917, GO:0043066, P<0.01 ）、タンパク質安定化（GO： 0050821, PBactrian camel=0.00021, Pdromedary=3.44 × 10-19）、免疫反応（GO:0006955, GO:0051607, P<0.01）はラクダの両種において加速度的に進化を示した（補足データ8, 14）。 アルパカと比較して、T細胞共刺激（GO:0031295, PBactrian camel=8.67 × 10-32, Pdromedary=9.33 × 10-9）、酸化還元過程（GO：0055114, PBactrian camel=4.4 × 10-9）に有意な機能カテゴリーが同定された。88 × 10-15, Pdromedary=5.22 × 10-21）、酸化還元酵素活性（GO:0016491, PBactrian camel=2.27 × 10-10, Pdromedary=7.23 × 10-7）があり、いずれも両キャメルで加速度的に進化した（補足データ6、12）。 また、3つの遺伝子（ERP44、NFE2L2、MGST2）は酸化ストレス応答と相関し、両ラクダゲノムでユニークなアミノ酸残基の変化を示した。 ドロメダリーの拡大した遺伝子ファミリーは、チトクロムc酸化酵素活性（GO:0004129, P=5.80×10-10） とモノオキシゲナーゼ活性（GO:0004497, P=1.32×10-5） に富むことが分かった（補足表37）。 これらの結果は、砂漠環境の厳しい乾燥条件に適応するためにラクダが選択された証拠となる。

呼吸器系の適応

砂漠環境のもう一つの課題は空気中の塵であり、喘息などの呼吸器疾患を引き起こす可能性がある。 両ラクダのFOXP3、CX3CR1、CYSLTR2、SEMA4Aなど13のPSGは、ヒトの呼吸器疾患と関連していた。 また、肺の発達GOカテゴリー（GO:0030324, PBactrian camel=3.26 × 10-5, Pdromedary=1.18 × 10-19）（補足データ6、12）はアルパカに比べてドロメダリーとバクトリアンキャメルで急速に進化していることがわかった。

視覚系の適応

砂漠環境のもう一つの側面として、日射が挙げられる。 紫外線に長期間さらされると、さまざまな眼科疾患につながる可能性がある。 砂漠の極端な太陽光線にラクダの目を慣らす可能性のある遺伝子を調べたところ、光受容と視覚保護に関連するOPN1SW、CX3CR1、CNTFR遺伝子に正の選択を確認し、両ラクダで確認された。 また、視覚知覚（GO:0007601, PBactrian camel=0.0018, Pdromedary=2.49 × 10-14）はアルパカと比較して両ラクダで急速に進化したことが示された（補足データ6、12）。 これらの結果は、ラクダが視覚系にダメージを与えることなく長時間の紫外線照射に耐える能力の遺伝的基盤を示唆している。

塩分代謝

次に、塩分が水収支に及ぼす主な影響を考え、ラクダの塩分代謝に注目した。 塩分耐性に関する先行報告3とは対照的に、ナトリウムイオン輸送のカテゴリー（GO:0006814、PBactrian camel=0.0014, Pdromedary=0.00012） は、牛よりもラクダで急速に進化したことが示された（補足データ8、14）。 電位依存性カリウムチャネル複合体に関連するカテゴリ（GO:0008076, PBactrian camel=8.77 × 10-8, Pdromedary=2.68 × 10-10）は、アルパカと比較して、ラクダの両方で急速に進化した（補足データ6、12）。 また、ラクダのゲノムにはNR3C2遺伝子とIRS1遺伝子の2つのコピーが含まれており、これらは腎臓でのナトリウム再吸収と水分バランスに重要な役割を果たしている24,25,26が、他の哺乳類ではそれぞれの遺伝子を1つしか持っていない。 この違いは、ラクダがアルパカやウシよりも効率的に塩分を代謝・輸送し、これらの経路が水の再吸収に重要である可能性を示唆している。

微量発現遺伝子と濃縮解析

乾燥砂漠への適応の特徴をより深く知るために、24日間水制限（WR）したバクトリアンキャメル群と対照群（CG）の腎皮質および髄質のトランスクリプトームの配列を決定した（補足表45、補足データ15、16）。 これらの組織で有意にアップレギュレートまたはダウンレギュレートされた遺伝子を選択し（Supplementary Figs 18-21 and Supplementary Methods）、これらの遺伝子の濃縮GOカテゴリーを分析した（Supplementary Figs 22-25, Supplementary Data 17-20 and Supplementary Methods）。 金属イオン結合 (GO:0046872, P=1.53 × 10-23) および体液レベルの調節 (GO:0050878, P=1.37 × 10-6) に関連するカテゴリーの過剰発現が、発現量の多い腎皮質遺伝子セットで検出された (補足データ 17)。 グルコース代謝過程（GO:0006006, P=4.11 × 10-6）、糖新生（GO:0006094, P=0.0026）、ミトコンドリア（GO:0005739, P=2.13 × 10-5） 、前駆代謝物およびエネルギーの生成（GO:0006091, P=0.0077）、栄養素レベルへの応答（GO:0031667, P=0.0064 ）、ストレスへの応答 （GO:0006950, P=0.006 ）に関わるGOカテゴリーが検出された。0094）が発現上昇した腎髄質遺伝子セットに濃縮されていた（補足データ19）。

ナトリウム再吸収

腎臓でナトリウムを再吸収するNa+/K+-ATPaseと上皮Na+チャネル（ENaC）をコードする遺伝子はWR条件で腎皮質と髄質に発現上昇した（補足表46、47）。 異なる組織、異なる条件下でENaCのサブユニットが柔軟に転写されることから、ラクダは異なる生理的水分要求量に対応するために、ENaCのNa+再吸収活性を調節していることが示唆された。

Water reservation

ラクダは長期の水制限に適応することで知られている． そこで、水の再吸収や代謝に重要な機能を持つ選択的水チャネルであるアクアポリンファミリー遺伝子の転写を解析し、水予約のメカニズムを検討した。 AQP1、AQP2、AQP3はWR条件下で腎皮質と髄質で発現が異なる上位3つの遺伝子であった（補表48、49、補図26）。 これらの遺伝子は、水不足の環境下でラクダがより効率的に水を再吸収することを可能にしているのかもしれない。 しかし、バクトリアラクダの腎臓ではAQP4のmRNAは検出されず、砂漠のげっ歯類Dipodomys merriamiで発現がないこと27と一致するが、ヒトの腎臓で豊富に発現していること28とは対照的であった。 興味深いことに、バクテリオン・ラクダゲノム中のAQP4には、ユニークなアミノ酸残基変化（R261C）が観察された（補足図27）。 これらの知見は、ラクダの腎臓における水の再吸収と代謝のユニークな戦略を示唆していると考えられる。

Osmoregulation

腎臓における水のバランスと再吸収の基礎は高張性であるので、腎髄質の浸透圧調整に関与する遺伝子の発現を分析した。 哺乳類で唯一知られている張力制御転写因子29 であるNuclear factor of activated T-cells 5 (NFAT5) はWR条件下でコントロールレベルの3.66%で発現していた（補足表50）． したがって、ナトリウム／ミオイノシトール共輸送体（SMIT）、ナトリウムおよび塩化物依存性タウリントランスポーター（TauT）、ナトリウムおよび塩化物依存性ベタイントランスポーター（BGT1）はWR条件で発現が減少することが示された。 NFAT5によって活性化されたこれら3つのトランスポーターは、高張力化に応答して腎髄質細胞（RMC）に適合する有機オスモライトを輸送する30 (Fig. 4)。 高張力ストレス時のNFAT5とその標的遺伝子のダウンレギュレーションは、Spinifex hopping mouse (Notomys alexis) 32のような砂漠の動物を含む他の哺乳類では観察されていない29,31。

ボックスの網掛けは、バクトリアンラクダの腎髄質におけるWR中の遺伝子の発現上昇（赤）、発現一定（白）、発現低下（緑）を示している。 破線は、遺伝子発現及び関連産物の活性の最終的な機能又は効果を示す。

有機オスモライト

有機オスモライトの蓄積は、RMCsが細胞内と細胞外の環境の浸透圧のバランスを取るのに役立っている30。 TauT，BGT1，SMITのダウンレギュレーションは，タウリン，ベタイン，ミオイノシトールの細胞内への輸送が減少していることを示唆する． 驚くべきことに、ソルビトール経路ではアルドース還元酵素（AR）の転写上昇とソルビトール脱水素酵素（SDH）の転写低下が観察された。また、グリセロホスホコリン（GPC）経路では神経障害標的エステラーゼ（NTE）の転写上昇とグリセロホスホジエステラーゼドメイン含有タンパク質5（GDPD5）の安定転写が見られた（図4、補足表50）。 これらの遺伝子の発現パターンから、ラクダではWR条件下でソルビトールとGPCが蓄積し、オスモライトは主にRMC自体で産生されている可能性が示唆された。 ソルビトールはエネルギー源として機能し33、高い細胞外NaClの浸透圧のバランスをとるのに役立ち34、腎髄質の高いNaClや尿素に反応してGPCが蓄積するエネルギーコストは、高い濃度勾配に対してベタインを細胞内に輸送するコストよりも小さいかもしれない30。 このように、浸透圧関連遺伝子の発現の変動は、食料の乏しい砂漠でラクダが生存するための低エネルギー消費モデルの一部として、高張性に対して5つの浸透圧ではなく2つの浸透圧が主に使用されることを示す。

重要なことは、WR条件下で腎髄質にグルコース輸送体1 (GLUT1) と解糖に関わる遺伝子の発現レベルが大幅に増加したことを確認した（補足表51）ことである。 GLUT1の発現レベルが浸透圧ストレスや代謝ストレスによって誘導されるという以前の報告35と合わせると、グルコース摂取量の増強はソルビトールの合成に十分なグルコース濃度を確保するだけでなく、適応した高張性の内部イオン勾配を維持するために、発現が上昇したNa/K-ATPaseが必要なエネルギーを供給することが示唆された（図4）。 これらのことから、ラクダの特徴的な高血糖（6-8 mmol l-1）36,37は、抗利尿時のRMCsの浸透圧調節と水分再吸収のための適応的な進化戦略である可能性が示唆された。

Osmoprotection

細胞への高浸透圧障害の可能性30を考慮して、細胞保護に関連する遺伝子の発現を分析したところ、WR条件下の腎髄質では抗酸化物質および関連酵素をコードする25の遺伝子（補足表52）の発現レベルが高いことが判明した。 また、Nrf2、熱ショック因子-1、活性化蛋白-1複合体、p53、核因子-κB、シグナル・トランスデューサー・アクティベーター・オブ・トランスリクション4などの抗酸化転写因子をコードする遺伝子もWR腎髄質で発現が上昇した。 さらに、高浸透圧下でミスフォールドしたタンパク質の除去に寄与する熱ショック遺伝子30が、WR腎髄質で発現上昇することを確認した（補足表52）。 細胞保護シャペロンである遺伝子clusterinは、WR腎髄質で〜8.9倍と劇的に増加し、最も高い転写レベルを示した（reads per kilobase per million mapped reads=27,069 ）。 これまでの研究で、clusterinはグルコースによって誘導され38、糖尿病39や腎臓障害40などの多様な病態に関連することが示されている。 ドロメダリーのPSGとしてクラステンが同定されたことは、この遺伝子が水分制限中のラクダ腎髄質の細胞保護に大きな役割を果たす可能性を示唆し、ラクダの高血糖が浸透圧保護時の機能を果たしている可能性を示唆している。 全体として、浸透圧保護遺伝子のアップレギュレーションは、ラクダがWR条件下で高度な浸透圧保護能力を持っていることを示している

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