Cell death is crucial for the proper execution of normal and pathophysiological processes and isubiquitous in biological systems.これは、正常なプロセスや病態生理学的プロセスを正しく実行するために不可欠なものであり、生物界に偏在しています。

プログラムされた形態の細胞死は、発生時の形態パターンの生成、免疫時の負の選択、感染時のウイルスと宿主遺伝子の間で起こる分子の「軍拡競争」、および遺伝毒素などの環境ストレス要因で起こる組織損傷に関与している。

これらの細胞死経路における変化は、がん、変性疾患、後天性免疫不全症候群（AIDS）などの疾患として現れることがあります。 近年、核の断片化や膜の透過性など、死にかけた細胞の個々の特徴を測定するだけでは、アポトーシス、自食性細胞死、ネクローシスなどの異なる細胞死経路を識別するのに十分ではないことが明らかになっています。

求められているのは、「舞台裏」で起きているメカニズム的な出来事を明らかにする、細胞死のマルチパラメーター評価です。 2009年の細胞死命名委員会の勧告によると、細胞死に関連するプロセス（アポトーシス、ネクローシス、オートファジー）は、形態的外観、酵素学的基準、機能的側面、免疫特性によって分類することができる

様々な形態の細胞死

アポトーシス

アポトーシスは遺伝子によって誘導される細胞自殺プログラムを指しています。 細胞表面の受容体、プロテアーゼ、ミトコンドリア成分を含む多種多様な細胞タンパク質が、細胞の生存とアポトーシスによる死との間の微妙なバランスを調節しているのである。 これらのタンパク質に変異が生じると、バランスが崩れ、腫瘍細胞が無制限に生存・増殖する可能性がある。 したがって、アポトーシスのメカニズムを解明することは、このような細胞死を治療目的に利用する新しい戦略を生み出す可能性がある。

アポトーシスには、細胞体積の減少、核の凝縮、DNAの断片化、細胞膜の剥離、食細胞による取り込みが伴います。 さらに、アポトーシスは通常、ミトコンドリア膜の透過とそれに続くカスパーゼカスケードの活性化を伴うが、カスパーゼ以外のプロテアーゼが代替的に活性化される場合もある。

ネクローシス

ネクローシスは歴史的に受動的な細胞死と見なされていた。 しかし、最近のデータでは、ネクローシスはプログラムされた細胞死の代替形態でもあり、その活性化は炎症反応を引き起こすなど、重要な結果をもたらす可能性があることが示唆されている。 ネクローシスとアポトーシスは、形態的に非常に区別される。 ネクローシスは、細胞体積の増加、小器官の膨張、細胞膜の破裂および細胞内内容物の喪失を伴う。

アポトーシスとネクローシスの違いに関して、アポトーシスとネクローシスの細胞死を区別する様々な方法は、細胞のサイズ、細胞の断片化、DNA切断など、視覚化および／または測定可能な特徴に依存しています。

オートファジー

オートファジーは、細胞がリソソーム機構を介して自身の成分を破壊し、それらを再利用する、高度に制御された恒常性分解プロセスである。 この過程は、アルツハイマー病、老化、癌、クローン病などの多様な疾患と関連している。 また、オートファジーの増加は、アポトーシス誘導経路とのクロストークにより、細胞死を引き起こす場合もあります。 オートファジーとアポトーシスによる細胞死の相関を理解することは、特に腫瘍生物学における多くの研究の焦点となっています。

Autophagy vs Apoptosis

オートファジーによる細胞死は、形態学的には、クロマチン凝縮がなく、細胞質の大量の空胞化を伴って起こる細胞死と定義されています。 アポトーシスとは対照的に、オートファジーは食細胞との関連がほとんどない。 この細胞死の形態では、細胞質はオートファゴソーム内に隔離され、リソソームによる分解を受ける。

現在、アポトーシス経路とオートファジー経路の間にクロストークがあることが知られており、研究では、アポトーシスの重要な制御因子であるBCL2が、オートファジー経路の重要な制御因子であることも示されている。

近年のケミカルバイオロジー、パスウェイ解析、高度なサイトメトリーの進歩により、各細胞死経路を特徴づける分子マーカーや細胞変化について、より深い洞察が可能になった。 さらに、技術の進化により、これらの評価の多くをルーチンのベンチトップ実験として、下流の解析と並行して行うことができるようになった。 これらの進歩により、細胞死の研究は、複雑なシステムに統合された微妙なシグナル伝達ネットワークの解明へと変貌を遂げました。 各細胞死シグナル伝達経路には可逆的な点と不可逆的な点があり、様々な文脈の中で移行点がどこにあるかを決定することは、そのプロセスに介入しようとする立場から非常に重要である。 細胞死の種類に関係なく、一旦細胞が帰還不能点を過ぎると、死を防ぐことはできない。

細胞死の解析

さまざまな形態の細胞死を解剖し、特徴づけ、区別するためには、記述的（例：イメージング）かつ機能的（例：経路阻害）な2種類の基準が必要である。 例えば、DNA断片化とカスパーゼ活性化はそれぞれアポトーシスの定義に役立ちますが、アポトーシスはDNA断片化がなくても起こりうるし、カスパーゼ活性化も他の生物学的プロセスに関連しているので、これらの分析を単独で使用すると決定的なものではありません。

そのため、細胞死は常に複数の方法を用いて、できれば同じサンプルで、可能であれば生化学的および形態学的アッセイを組み合わせて測定すべきである。 イメージング、TUNEL、免疫学的アッセイ、フローサイトメトリー、イメージングベースサイトメトリー、接着細胞のイメージング技術など、さまざまな技術によってさまざまな細胞死経路に関する価値ある情報を得ることができる。 しかし、細胞死を調査するための現在の方法には、その有用性を制限しかねない、いくつかの共通した固有の欠点がある。

例えば、ウェスタンブロッティングやELISAなどの技術は、プロセスの総変化に関する情報を収集するのには非常に有用であるが、細胞ごとの特異的な変化を提供することはできない。 ある種のイメージング法は、サンプル間で同等の数の細胞がカウントされるかどうか、または十分な細胞がカウントされるかどうかに制限があり、結果の再現性および／または正確性に影響を与える可能性がある。

他方、マルチパラメトリックフローサイトメトリーまたはイメージングサイトメトリーなどの方法は、非常に強力で、細胞死解析のための内容豊かなデータを提供できるが、これらの方法にも制限がある可能性がある。 例えば、装置へのアクセスが制限されていたり、多くの専門知識やトレーニングが必要であったり、購入しやすい価格であることが課題であったりする。

研究者が細胞の健康と細胞死について調査している一般的で日常的な疑問に対する答えを強固に、正確に、再現性よく提供できる、使いやすく、手頃でアクセスしやすい方法論が業界では求められています。 アポトーシス、ネクローシス、オートファジーを効果的に識別するための確立された方法と新しい方法を以下に説明します。

イメージング

細胞死は究極的には形態学的プロセスであり、このプロセスを分析するためのゴールドスタンダードは、細胞を可視化することです。 細胞死が培養で目撃されると、何が起こっているのかが非常に明らかになる。 例えば、アポトーシス時には、細胞が丸くなり、沸騰しているように見える（「ブリービング」）。 細胞死のイメージングには、培養中の細胞をリアルタイムで可視化する方法、細胞をアクリジンオレンジ（アポトーシス細胞に特異的な重要な色素）で染色する方法、固定組織を組織学的に染色する方法、電子顕微鏡による方法など、さまざまなアプローチがある。 また、以下に述べるように、イメージサイトメトリーにも新しい選択肢があります。

Terminal Deoxynucleotidal Transferase dUTP Nick End Labeling (TUNEL)

The Terminal Deoxynucleotidal Transferase dUTP Nick End Labeling (TUNEL) procedures is a very common method for examine DNA fragmentation that resulted from apoptosis. TUNELは、クロマチン中のヌクレオソーム間のスペーサー領域で切断されたDNAの末端を標識し、これらのDNA鎖切断を光学顕微鏡で可視化するものである。 TUNELはアポトーシスの非常に有効なアッセイであるが、このアプローチの一つの大きな限界は、TUNELがプロセスの最も新しい段階でアポトーシス細胞を検出することである。

カパーゼ活性化

分子レベルでは、壊死ではなくアポトーシスの細胞死経路の実行に大きく関与するのがカスパーと呼ばれる一連の酵素群である。 アポトーシスのシグナルに応答して、カスパーゼはタンパク質の基質を切断する一連の反応に参加し、細胞の解体を引き起こす。 カスパーゼは、プロ酵素として生体内のあらゆる細胞に存在し、休眠状態となっている。 アポトーシス時には、カスパーゼは活性な酵素四量体分子を形成し、基質を活性化または不活性化することができる。

これらの酵素は、アスパラギン酸残基を含む標的基質上の4～5個のアミノ酸配列を特異的に認識し、切断のターゲットとする。 カスパーゼは免疫など他の生物学的プロセスでも機能しており、実際、多くのウイルスゲノムがこれらのカスパーゼの直接的な阻害剤をコードしている。 カスパーゼは、カスパーゼ特異的抗体を用いた免疫沈降法やイムノブロット法、あるいはカスパーゼの切断により蛍光を発する基質を用いて検出することが可能である。 さらに、カスパーゼの関与は、アポトーシスの非常に強力な誘導物質であるSmac mimeticで生きた培養物を処理することによって可視化することができる。 ミトコンドリア内部膜貫通電位の損失は、常にではありませんが、しばしばアポトーシスの初期段階と関連して観察され、カスパーゼ非依存性の細胞死に関与していると考えられています。 ミトコンドリアの機能状態を評価するように設計された蛍光ベースのアッセイは、アポトーシスカスケードにおけるミトコンドリア活性の役割を検討するための有用なツールである。

Phosphatidylserine and annexin V

生細胞の内膜リーフレットに閉じ込められていたPhosphatidylserine（PS）は、アポトーシス初期に露出膜表面へ移動する。 この現象は、食細胞に対して攻撃するためのシグナルとして機能する。 PSは主にアポトーシス細胞の表面のブリープで露出する。 アネキシンVは負に帯電したPSを含む膜に高い親和性を持つ。 これらの現象はフローサイトメトリーを用いて可視化することができる。 アポトーシスに関する初期のフローサイトメトリーアッセイは、エタノール処理後の前方および側方散乱とDNA断片化の変化を分析したものです。 現在では、初期のミトコンドリア変化からカスパーゼ活性化、膜変化、DNA損傷まで、アポトーシスのほぼすべての段階を対象としたフローサイトメトリーアッセイを提供しています。 以前のアッセイとは異なり、フローサイトメトリーは個々の細胞におけるアポトーシスを分析する。

Multiparametric flow cytometryは、複数の細胞死アッセイを組み合わせるのに理想的なアプローチである。 FLICAカスパーゼ検出、アネキシンVおよび細胞永久DNA結合色素（例えば、ヨウ化プロピジウム）を組み合わせて、強力なアポトーシスの多段階アッセイにすることができます（図1）。

この技術により、2つのマーカーを同時に解析し、タイムコースおよび用量反応試験を行うことができるため、細胞死プロセスの包括的なイメージだけでなく、作用しているメカニズムについてより深い洞察を得ることができます（図2）。

現在までに、オートファジーの分析に利用できるフローサイトメトリーアッセイは、軽鎖3（LC3）の測定を含む1つのみである。 LC3は、機能不全のミトコンドリアや他の細胞内小器官を貪食するオートファゴソームに分別され、最終的にはリソソームに分別されるタンパク質である。 オートファジーは、緑色蛍光タンパク質（GFP）-LC3トランスロケーションを用いたフローサイトメトリーによって検出することができます（図3）。

このアッセイでは、細胞株はGFP-LC3で安定的にトランスフェクトされる。 誘導の際に、リソソームによるオートファゴソームの破壊を阻止するためにリゾチーム阻害剤を添加する。 オートファジーが起こる場合、阻害剤が存在するとGFP-LC3はオートファゴソームに蓄積し、培地中に放出されなくなります。 オートファジーが起こらない場合、GFP-LC3は細胞質に蓄積され、培地中に放出されます。 オートファゴソームと結合したGFP-LC3は、フローサイトメトリーにより無傷の細胞で検出することができる。

Image cytometry

Image cytometryでは、細胞計測データと相関する細胞画像を同時に収集でき、現在はこの種の分析に多くのオプションが存在する。 アポトーシスは非常に多様であり、多面的であるため、イメージングによってアポトーシスが起こっていることを確認でき、またクロマチン凝縮や細胞骨格破壊の可視化によってそのプロセスをある程度特徴づけることができる。 また、イメージサイトメトリーには、アポトーシス解析に有用なピクセル単位の解析などの追加的な解析オプションが用意されています。 さらに、アポトーシスラベルを「濁らせる」可能性のあるトリプシンやAccutase®の剥離は必要ありません。

また、イメージサイトメトリーでは、細胞を基質から除去することなく、付着した細胞を分析することができます。 このため、多くの研究室では、付着したアポトーシス細胞の解析にイメージサイトメトリーを利用している。 付着細胞は、掻き取りやトリプシンによって基質から剥がされると、アポトーシス表現型が乱されたり、アポトーシスのプロセスそのものが誘発されたりすることがあります。 イメージサイトメトリーでは、チャンバースライド上の細胞を直接染色することにより、解析中も接着した細胞を維持することができます。 また、ストリームベースのイメージサイトメトリーシステムは、サイトメトリーと画像の直接的な相関を提供し、それによってサイトメトリーと形態学的な分析を融合させることができる。 ストリームベースイメージングシステムでは、細胞はスライド上で撮像されるのではなく、ストリーム内で直接撮像される。 細胞計測と画像解析の相関により、生存細胞、初期、中期、後期のアポトーシス細胞をゲーティングし、解析することができる（図4）。

結論 – 細胞死。 アポトーシス、ネクローシス&オートファジー

細胞死は、発生と恒常性の両方のための多くの正常な生理的機能に不可欠な自然なプロセスである。 さらに、細胞死シグナル伝達経路の変化は、様々な疾患と関連している。 死にかけた細胞の個々の特徴を測定することは、アポトーシス、ネクローシス、オートファジーを含む異なる細胞死経路を識別するのに十分ではない。その代わりに、記述的および機能的基準の両方を含むマルチパラメーター評価が必要である。

最近の技術の進歩により、各細胞死経路を特徴づける分子マーカーや細胞変化についてより深い洞察が可能になり、また、これらの分析の多くをルーチンのベンチトップ実験として実施することができるようになった。 DDW

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この記事はもともとDDW 2014年冬号で紹介されました

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Dr John Abramsは細胞生物学の教授で、研究では細胞死の制御に関わるin vivo分子ネットワークを調べ、クロマチン組織の決定因子を探求しています。 1994年にテキサス大学サウスウェスタン医療センターに着任し、2004年に遺伝学・発生学大学院のプログラムチェアに就任した。 Abrams博士はスタンフォード大学で博士号を取得した。

ウィリアム・G・テルフォード博士は1999年に米国国立衛生研究所の国立癌研究所のスタッフ科学者となり、NCI実験移植・免疫部門のフローサイトメトリー中核研究室のディレクターを務めている。 ミシガン州立大学で微生物学の博士号を取得し、ミシガン大学医学部で免疫学の博士課程を修了した。

Louise RollinsはEMD Millipore Corporationのプロダクトマネージャーで、小型フローサイトメーターであるMuse® Cell Analyzerと、細胞の健康と細胞死を日常的に分析するためのアプリケーション固有のアッセイキットおよびソフトウェアモジュールの開発をサポートしています。