Properties and Detection of Botulinum Neurotoxin

Clostridia は微生物の他の属よりも多くの種類のタンパク質毒素を産生する。 ボツリヌス菌の際立った特徴は、並外れた効力の神経毒を合成する能力です。 BoNTは薬理学的に類似した毒素で、末梢のコリン作動性シナプスに結合し、神経筋接合部でのアセチルコリンのエキソサイトーシスをブロックする。 BoNTは、ボツリヌス神経毒素と無毒性タンパク質が結合した前駆毒素複合体として、食品中、腸内、培養系で産生される。

ボツリヌス中毒の診断は、一般に患者の臨床症状の評価によって、また食品を媒介とする集団発生については、共通の食品を食べた人々の集団に関わる症例の集積によって達成される。 C. botulinumの芽胞は環境中に広く存在し、多くの食品を汚染しているため、ボツリヌス中毒のほとんどの調査では、BoNTの存在を検出することが第一の目的である。 血液、胃内容物、食品からBoNTが検出されれば、ボツリヌス中毒の確定となる。 疑わしい食品、ボツリヌス中毒の症状を持つ幼児の糞便、または傷口から C. botulinum を分離することは、ボツリヌス中毒の診断の裏付けとなる証拠となります。

BoNTは、食品または臨床試料から抽出された毒素のバイオアッセイを用いて検出することが望ましい。 抽出物はマウスに腹腔内注射され、動物は最大4日間、ボツリヌス中毒の典型的な兆候について定期的に観察される。 特徴的な症状としては、動物の運動能力の低下、毛並みの乱れ、呼吸困難、腹筋の収縮による「スズメバチ」のような形態、そして痙攣と死亡が続く。 これらの徴候を示す動物は通常24-48時間以内に死亡する。2時間より早く、あるいは48時間後に死亡した動物は、BoNT以外の物質で屈したものと考える必要がある。 BoNT による死亡は血清型特異的抗毒素による中和で確認される。

臨床検体および特定の食品から得た BoNT のマウスバイオアッセイでは、しばしば合併症が発生する。 特に、非ボツリヌス干渉物質による死亡はよくあることである。 これらの非特異的な死亡は、一般に、より強力なBoNTによって死亡が引き起こされる終点まで妨害致死物質を希釈することによって回避することができる。 時には、分析中のサンプルに複数の血清型のBoNTが存在することがあり、確認には混合抗毒素による中和が必要である。 食品または臨床検体では、感染またはエンドトキシンの存在により、非ボツリヌス菌による死亡が起こりうる。 感染性物質は、膜濾過や抗生物質の添加により除去することができる。 エンドトキシンを含む抽出物は一般的に適切な終点まで希釈するか、エンドトキシンを吸着により除去することができる。 C. botulinumの非タンパク質分解株（グループII）からの抽出物では、トリプシンなどのプロテアーゼによる活性化により毒性が増加する。 食品によっては、トリプシンが毒性ペプチドを生成することがあるので、30-60分後に大豆トリプシンインヒビターを添加して反応を停止させる必要がある。

有効なC. botulinumは、調理肉-グルコースブロスやペプトン、酵母エキス、グルコースを含む培地などの適切な増殖培地で濃縮して食品から分離することが可能である。 C. botulinumは複雑な栄養所要量を持っており、増殖のために豊富な培地を必要とします。 分離のためには、食品または臨床検体の一部を80°または60°Cで加熱し、それぞれI群およびII群のC. botulinumの芽胞を選択することがしばしば有用である。 時には、50％エタノールを使用して、グループII C. botulinumを分析する食品サンプルの植物細胞を不活性化することがあります。 濃縮後、BoNTの存在は、前述のようにマウスバイオアッセイによって測定される。

BoNTの検出のために様々な免疫学的方法が開発されてきたが，そのほとんどはマウスバイオアッセイほど感度が高くなく，また生物学的に不活性なBoNTを検出する可能性があるという欠点がある． これらの欠点を軽減するために酵素結合免疫吸着法（ELISA）がいくつか進歩し、ELISAはマウスバイオアッセイを補完するために使用されるが、それに取って代わるものではないと思われる

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