実験

Post-Up!死後検体採取

前述したように死後3時間後に大腿部の血液を採取した。 硝子体、尿、肝臓、胃内容物は死後20時間後の剖検時に採取した。 すべてのサンプルは分析するまで冷蔵保存された。

毒物学的分析

死後の大腿血は、アルコールと揮発性化合物（GC-FIDヘッドスペース）、一酸化炭素（紫外線-可視）、エチレングリコール（GC-MS）のスクリーニングが行われた。 ELISAによる一般的な乱用薬物（アンフェタミン、バルビツール酸、ベンゾジアゼピン、カンナビノイド、コカイン／代謝物、フェンタニル、メタンフェタミン、メタドン、アヘン、オキシコドン／オキシモルフォン、フェンシクリジン）（Immunalysis Inc., Pomona, CA）、Loら（7）が発表したものと同様の液体-液体抽出による標準的な酸／中性薬物スクリーニング、FoersterとMason（8）が発表したものと同様の液体-液体抽出によるGC-MSによる標準的なアルカリ性薬物スクリーニングを実施した。 陽性結果は、その後の特異的な手法によって確認され、定量された。

材料

溶媒; メタノールはEMD Chemicals（ドイツ）から入手し、OmniSolvグレードはVWR International（Randor、PA）から、JT BakerはFisher Scientific（Hampton、NH）から購入した、EMD（ドイツ）からの水中アセトニトリル（20％）はFisher Scientific（Hampton、NH）から、塩化n-butylはEMD Chemicals（ドイツ）から、OmniSolvグレードはVWR International（Randor、PA）を通して、80:20水-アセトニトリル、5mM重炭酸アンモニウム（Fluka）および0.2% acetonitrile (Sigma) は Sigma (St. Louis, MO) から購入した。 濃縮水酸化アンモニウム（NH4OH）、濃縮塩酸（HCl）および0.5M硫酸（H2SO4）は、JT Baker through Fisher Scientific（Hampton, NH）から購入し、（1％v/v）メタノールHCLは社内で調製した。

陽性キャリブレーター／コントロール：ジフェンヒドラミンはCerilliant（ラウンドロック、TX）から入手した。 Lipomed社（Cambridge, MA）から入手したジフェンヒドラミンをメタノールで調製した第2原薬対照品。 内部標準：Cerilliant（Round Rock, TX）から入手したジフェンヒドラミン-d3、メタノールで調製した。 陽性校正物質/対照物質。 Cerilliant社（Round Rock, TX）より入手したcyclobenzaprine。 Lipomed (Cambridge, MA)から入手したセカンドソースコントロール、メタノールで調製。 内部標準：Toronto Research (North York, ON, Canada) から入手したシクロベンザプリン-d3をメタノールで調製。

Methods

Alkaline drug screen

内部標準としてメピバカイン、Foerster と Mason (8) が発表したものと同様の修正液体-液体抽出を用いて、GC-MSをフルスキャンで使用して症例試料と該当対照を分析しました。 ジフェンヒドラミン、シクロベンザプリン、デュロキセチンは、相対保持時間とフルスキャンマススペクトルに基づいて同定されました。

MSフルスキャンモードによる分析物の推定的同定は、参照標準と比較した保持時間（RRT）一致と、少なくとも3つの最量イオンを含むライブラリマッチを適切な比率で含んでいます。 大腿骨血液、硝子体、肝臓、尿および胃は、デュロキセチンの定量のためにNMS Laboratoriesに送られました。

Diphenhydramine quantitation analysis (GC-MS SIM)

Diphenhydramine is measured using a deuterated internal standard and the modified Foerster (8) extraction procedure. Cerilliant (Round Rock, TX) 製のキャリブレーターと Lipomed (Cambridge, MA) 製のコントロールは、1.0 mg/mL 標準物質からメタノールで調製されました。 ジフェンヒドラミン-d3 は Cerilliant (Round Rock, TX) から購入した。 分析は、Agilent Technologies 7890A ガスクロマトグラフおよび Agilent Technologies 5975C イナート XL MSD によって行った。 分析カラムは HP-1 MS (15 m、直径 0.25 mm、厚さ 0.25 µm) で、キャリアガスとしてヘリウムを使用しました (0.9 mL/分)。 オーブンは、初期温度100℃で1分間、20℃/分で320℃までランプするようにプログラムされました。 ジフェンヒドラミンのモニターイオンは58.1 m/z（定量イオン）と73.0 m/z、ジフェンヒドラミン-d3は61 m/z（定量イオン）と76 m/zであった。 シクロベンザプリンの定量分析 (LC-MS-MS dynamic multiple reaction monitoring, DMRM)

シクロベンザプリンは、重水素化内部標準と修正Foerster (8) 抽出手順を用いて測定されました。 Cerilliant (Round Rock, TX) 製のキャリブレーターと Lipomed (Cambridge, MA) 製のコントロールは 1.0 mg/mL の標準溶液からメタノールで調製されました。 シクロベンザプリン-d3はToronto Research (North York, ON, Canada)から購入した。 分析は、エレクトロスプレーイオン化 (ESI) のポジティブモードで動作する Agilent 6410 LC トリプル四重極質量分析計 (Santa Clara, CA) と Agilent 1290 Infinity HPLC System からなる LC タンデム質量分析 (MS-MS) で行った。 クロマトグラフィーは、Waters X-Bridge BEH Phenyl カラム (2.1 × 50 mm × 2.5 µm) を使用して、グラジエント溶出で実施されました。 移動相は、DI水中の5 mM重炭酸アンモニウム（pH10）（移動相A）とLC-MSグレードのアセトニトリル中の0.2%酢酸（移動相B）から構成されています。 流速は0.6 mL/分です。 移動相グラジエントは0.0-9.0分、移動相Bは25から50%に増加、9.0-9.1移動相Bは75%に増加、10.5分までアイソクラティック保持、その後2分間の注入後平衡化期間を設けた。 注入量は4 µLで、カラム温度は55℃に維持された。 質量分析計はESIモードで、温度350℃、ガス流量8 L/min、ネブライザーガス圧45 psi、キャピラリーインターフェース電圧1500 V、デルタEMV +20、極性は正で窒素ガスを使用した。 シクロベンザプリンについてモニターされたイオンは、276.2 m/z > 84.1 m/z（定量イオン）、276.2 m/z > 58.2 m/z、276.2 m/z > 231.1; シクロベンザプリンd3 279.2 m/z > 87.1 m/z（定量のイオン）と 279.2 m/z > 61.2 m/z であった。 NMS labsの

Duloxetine Quantitation Analysis (LC-MS-MS)

硫酸亜鉛溶液によるタンパク質沈殿を伴う重水素化内部標準を使用して測定した結果、20〜1500 ng/mL の範囲で6点の検量線が作成されていました。 校正液およびコントロール液は、Cerilliant社（Round Rock, TX）から購入した1.0 mg/mLの標準液からメタノールで調製しました。 Duloxetine-d4はEli Lilly & Co.から入手した。 (Indianapolis, IN)から入手した。 分析は、Waters Acquity Ultra Performance LCシステムを備えたWaters TQD Tandem Mass Spectrometer (Milford, MA)によって行った。 使用したカラムは、Phenomenex Synergi Hydro-RP (2.0 × 50 mm, 2.5 µm) (Torrance, CA) と Thermo Aquasil C18, 2.1 × 10 mm, 5.0 µm pre-column guard cartridge (Bellefonte, PA)を使用しました。 デュロキセチン-d4のモニターイオンは、302.1 m/z > 46.9 m/z（定量イオン）および302.1 m/z > 158 m/z、デュロキセチンについては298 m/z > 43.8 m/z（定量）および298 m/z > 154 m/zである。 標準溶液は3.0～300 ng/mLの範囲で6点校正を実施しました。 尿、肝組織ホモジネート、胃内容液および硝子体液中のデュロキセチンの定量は、各検体について2段階の標準液添加で実施しました。 表IIに定量結果を示します。