Discussion

今回、我々はラット副腎皮質にMRとGRが存在することを明らかにした。 MRの活性を変化させるとZGでのアルドステロン産生が負のフィードバック機構に適合するように制御されることを示した。 この効果はMRに特異的であり、ZGにおけるGRの活性を変化させてもアルドステロン産生に影響を与えなかった。 副腎皮質における MR の発現とそのアルドステロン分泌調節の役割について報告されたのは、我々の知る限り、これが初めてである。 ZF/ZRにおいて、GRの活性を薬理学的に修飾したところ、同様のフィードバックループが観察された。 興味深いことに、MR の活性化は、ZF/ZR 細胞におけるコルチコステロン分泌を抑制することも確認された。 この結果は，副腎皮質内で合成されるステロイドによって副腎グルココルチコイド合成が調節されることを示した先行研究（Bairdら1983，Carsia & Malamed 1983，Darbeida & Durand 1987）と一致するものであった．

フルードロによるMR活性化は、HSとLSの両方の飼料で維持したラットから調製したZG細胞においてアルドステロン産生に負の効果を及ぼしたが、MR拮抗薬のカンレノイン酸は、LS飼料ラットのZG細胞においてアルドステロン分泌を増加させてステロイド生成を正の調節を及ぼした。 LS群ではHS群に比べ、より顕著な反応が見られた。 GRアゴニストおよびアンタゴニストがZG細胞からの基礎および刺激アルドステロン放出に影響を与えないことは、調節フィードバックループが受容体特異的であることを強く示唆している。 アルドステロンの産生と環境因子、例えばナトリウムやカリウムの摂取量、姿勢、1日の時間帯、体積減少との間には密接な関係がある。 これらの環境因子のレベルに対して、アルドステロンのレベルが不適切であると、ヒトや他の動物において様々な心血管疾患や代謝性疾患を引き起こすことが長い間立証されてきた。 したがって、正常なホメオスタシスを維持するためには、決定的な感度を持つ負のフィードバックループが重要である。 これは特に体積/ナトリウムのホメオスタシスに関連しており、環境中のナトリウム摂取量の経時的変化に対する反応のわずかなずれでさえ、実質的な心血管系の悪影響をもたらす可能性があるからである。 これらの潜在的な影響は、体積/ナトリウムのホメオスタシスを調節するシステム、例えば、レニン-アンジオテンシン系、アルドステロン、ナトリウム利尿ペプチド、エンドセリン、バソプレシン、腎臓（腎血流、近位尿細管、ヘンレループおよび遠位尿細管/集合管）にいくつかのチェックアンドバランスがある理由であると考えられます。 これらの調節因子は、部分的には、以下のように制御されている。 (1) 「長い」負のフィードバックループ、例えば、体積-レニン-アンジオテンシン-アルドステロンの負のフィードバックループ、(2) 相反する作用因子の作用方向、例えば、ナトリウム利尿ペプチドがアルドステロン分泌を抑制、 (3) 超短いフィードバックループ、例えば、アンジオテンシンIIとアンジオテンシン受容体型1が作用して柔毛体からのレニン放出を直接抑制する、など。 このような超短期的なフィードバックループの機能は、酵素の機能を抑制するというほぼ普遍的な概念と類似している面がある。 アンジオテンシンIIの作用と並行して、アルドステロンとMRのレベルを用いて、アルドステロン産生を最終合成点で修正する超短期フィードバックループも存在するという仮説が、今回の研究で支持された。 このステップでは、アルドステロンの産生が、現在その生物が存在する環境に適したものになるよう、さらに洗練されたものになる。 もちろん、これらの体積恒常性維持機構において、機能不全が心血管機能障害や疾病につながるもう一つのポイントも提供する。 これらの可能性に関連する可能性を秘めた報告が2つある。 RU 486がアルドステロン分泌に影響を及ぼさなかった正常なZG細胞における本研究とは対照的に、2つの変化した条件、原発性アルドステロン腫瘍細胞（Burtonら 2011）およびZucker肥満高血圧ラット（Clapham & Turner 1997）では、RU 486は血漿アルドステロン値を抑制するが血漿コルチコステロン値は抑制しない。 本研究と同様に、RU 486は対照ラットのアルドステロンレベルを変化させなかった(Clapham & Turner 1997)。 興味深いことに、腫瘍細胞では、MR拮抗薬はアルドステロン産生に影響を与えなかった。 MRの活性化は行われなかった。 細胞調製物において同レベルのアルドステロンとコルチゾールが認められたため、細胞の混在が存在するか、変化した細胞型が存在した（Burton et al.2011）。 最後に、本研究の結果は、生理学的および臨床的な関連性が高いことから、副腎以外のステロイドの調節にも応用できると考えられる。

MR活性の変化は、どのようにアルドステロン分泌を修飾するのか? アルドステロン産生の抑制と同時にコルチコステロン分泌が増加することから、アルドステロン生合成の後期経路が調節の場であることが示唆される。 アルドステロン合成の最終段階は、CYP11B2（アルドステロン合成酵素）の活性に依存する（Mornetら、1989）。 コルチコステロンからアルドステロンへの変換の減少は、実験時間が短い（1時間）ため、CYP11B2の発現量の変化ではなく、CYP11B2の活性の減少による可能性が最も高いと思われる。

低ナトリウム摂取はアルドステロン分泌を刺激することが知られており (Marusic & Mulrow 1967, Aguilera & Catt 1979) 、我々の結果はこれらの報告と一致するものであった。 高塩分食によって血清コルチコステロンが上昇することが観察された。 血清コルチコステロンの上昇と一致して、高塩分食を摂取したラットの単離 ZF/ZR 細胞は、基礎コルチコステロン分泌が高いことを示した。 ナトリウム欠乏ラットの副腎ではコルチコステロンの分泌が減少していることが以前の研究で示されているが（Eisenstein & Strack 1961）、食事性ナトリウムがコルチコステロン分泌に影響を与えるメカニズムは解明されていない。 コルチコステロンはZF/ZRとZGの両方で産生されるが、循環コルチコステロンの大部分はZF/ZRから産生されており、その質量がかなり大きいためである。 しかし、ZG細胞からの基礎的なコルチコステロン放出は、食事によるナトリウム摂取量の変化に影響されないことから、ZF/ZR細胞は、ナトリウムの大量摂取による血清コルチコステロンの上昇に寄与すると推測された。

グルココルチコイドとGRがグルココルチコイド産生を調節する副腎内フィードバックループの存在は、いくつかのin vivo (Peron et al. 1960, Hill & Singer 1968) およびin vitro研究 (Morrow et al. 1967, Carsia & Malamed 1983) によって古くから示唆されてきた。 これらの研究では、グルココルチコイドがグルココルチコイド産生を抑制するのか刺激するのかについて、対照的な結果が報告されている。 調節の方向は、使用した実験モデルや投与期間に依存するようである。 本研究では、コルチコステロン分泌に対する負の調節フィードバックがCarsia & Malamed（1983）の知見と一致する証拠を提供するが、他の研究者は反対の知見を報告している（Darbeida & Durand 1987, Li et al.2011, Asser et al.2014 ）。 多くの研究があるにもかかわらず、グルココルチコイドがステロイド生成を制御するメカニズムはよく理解されていない。 DEX処理によりACTH刺激ZF/ZR細胞でのみコルチコステロン分泌が著しく抑制されるという我々の結果は、グルココルチコイドがACTHとその受容体の結合を減少させることを示唆するLatnerらの知見（Latner et al.1977）と一致する。 さらに、グルココルチコイド拮抗薬であるRU 486は基礎的なコルチコステロン分泌には影響を与えなかったが、ACTHによるコルチコステロン産生を促進した。 これらのデータは、GR活性がZF/ZR細胞のACTHに対する感受性を変化させる可能性を示唆している。 より長い培養時間を用いた他の研究は、グルココルチコイドがタンパク質合成を阻害し、副腎皮質のいくつかの標的遺伝子上の転写を調節することを示唆している（Morrowら、1967、Aserら、2014）。 本研究では実験期間が長いため、この説明は考えにくいが、ゲノム効果が我々の観察に寄与している可能性は排除できない。

本研究で得られた驚くべき発見は、ZGとは対照的にZF/ZRが受容体特異性を示さないということであった。 GRやMRを活性化するとZF/ZRでのコルチコステロン産生を抑制することができる。 MR の活性化はグルココルチコイド産生を調節することが報告されているが、この効果は脳内のみで実証されている。 ヒトにフルドロコルチゾンを投与すると、視床下部-下垂体軸（HPA）のダウンレギュレーションによりコルチゾール濃度を抑制することがわかった（Otte et al.2003、Buckley et al.2007、Lembke et al.2013 ）。 グルココルチコイドのHPAフィードバック制御におけるMRの明確な影響は、カンレノイン酸がコルチゾールとACTH分泌に反対の効果を持つことが示されたときにさらに示された（Arvatら、2001年、Wellhoenerら、2004年）。 我々の発見は、MR活性が中枢でグルココルチコイド産生を調節することに加えて、副腎の局所でも調節できることを示唆しているが、その調節は明らかに食塩摂取量に依存するものである。 どちらの食餌でもACTHに応答してMRが活性化するとコルチコステロン産生が抑制されるが、理由は不明だが、低塩食ではコルチコステロンレベルが上昇するように見える。 生体内では副腎の血流はZGからZF/ZRに流れていることから、アルドステロンがグルココルチコイド産生にパラクライン作用を及ぼし、生理的および病態生理的に興味深い意味を持つ可能性がある。 ZF/ZRにはCYP11B2が存在せず、ZF/ZRとZG細胞は明確に異なる特徴を持ち、2つの細胞プレップで汚染があったとしてもほとんど見られなかったことから、これはあり得ないと考えている。 第二の制限は、本研究では、副腎ステロイド生成を制御する古典的な内分泌作用に対するこれらのパラクリン作用の相対的重要性を評価することができないことである。 3つ目の制限は、コルチゾールまたはコルチコステロンがMRと相互作用することによって、アルドステロンと同じ効果を持つかどうか分からないということである。 しかし、前述したように糸球体から筋層への血流の方向を考えると、もしそれが起こったとしても、局所的なパラクリン効果ではないだろう。 第四に、MRアゴニストとアンタゴニストがGRと交差反応する可能性を排除できない。 フルドロコルチゾンはいくらかのグルココルチコイド活性を発揮することが知られているが、そのMRに対する親和性はGRに対するそれの15倍である（Agarwalら、1977）。 カンレノイン酸とGRの相互作用については、どのような用量であっても、我々が知る限りでは報告はない。 第五に、ある操作が基礎ステロイド産生に影響を及ぼさなかった場合、我々のアッセイシステムが小さな影響を拾い上げるのに十分な感度を有していないという解釈も同様にあり得るため、何もないと確実に結論づけることはできない。 最後に、これらのラット研究のヒトへの外挿は不確かである。

結論として、副腎ステロイド生産を制御する古典的な長いフィードバックループに加え、本研究は、単離ZGおよびZF/ZR細胞におけるアルドステロン分泌とコルチコステロン生産にそれぞれ特異的に作用する、MRによる負の超短制御ループが存在するとする仮説を支持するものである。 我々は、MRの活性化がZF/ZR細胞のグルココルチコイド分泌も負に制御するという予期せぬ発見をしたことをここに報告する。 これらの短いフィードバックループが、長いフィードバックループとどのように相互作用するかは不明である。 しかし、これらの知見は、これらのステロイドの産生の生理的調節と潜在的な病態生理学的調節不全に関する興味深い問題を提起するものである

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