Abstract

• 生殖補助技術は多くの種で広く用いられている体外技術であり、健康面と経済面の両方で重要な役割を担っている。

• ここ数十年の間に、配偶子操作、凍結保存、体外受精、体外胚生産などの技術が大きく向上したが、これらの技術の効果は、生体内の状況に比べて最適とは言い難い。

• 生体内での配偶子の最終成熟、受精、初期胚の裂開は卵管内で起こるため、卵管内の環境を広く知ることで、自然の条件を実験室に反映させることで生殖補助技術の効率化に役立つと提案されている。

はじめに

多くの動物の受精は、卵管（子宮管または卵管）と呼ばれる女性の生殖管の特定の領域で起こる（図1および図2）。 卵管は、粘膜、筋層、結合漿膜からなる数層からなる複雑な線維筋性導体である。 これらの異なる層の大きさは、観察される卵管の解剖学的部位に依存する。 受精が行われるアンピュラでは、高度に折り畳まれた粘膜が観察されるが、イスムス領域、さらに子宮卵管接合部では折り畳みのサイズと数が減少する（図2c）。 イスムス領域は一般的に排卵前の精子の貯留に関連している。 受精にとって非常に重要なイベントは卵管で行われる。 例えば、卵管環境は、雌雄の配偶子の最終成熟、受精、初期胚の発生を担っています。 初期胚は着床する子宮に到達するまでに、卵管内で数日間を過ごすことを考慮することが重要である。 卵管は、主に血中ホルモン濃度の変化により調節される、様々な状況に適応するダイナミックな器官なのです。 配偶子や胚が一時的に置かれる卵管分泌物についての理解は、絶え間なく深まっています。 とはいえ、比較的乏しいのが現状であり、卵管液の生物学的活性に関する情報が増えれば、家事、経済、不妊関連で非常に有用である。 家畜の繁殖力は、遺伝的淘汰により低下することが確認されている（例：乳牛）（Diskin and Morris, 2008）。 このため、卵管液成分の研究が家畜やペットの様々な生殖補助技術（ART）の繁殖力や効率を向上させることを想定している。 これらの点については、以下に詳しく述べる。

Gamete-Oviduct Interactions

受精は卵管内のアンピュラという特殊領域で起こり、精子は細胞外の卵被膜（卵丘細胞および透明帯）を突き抜ける。 卵子と精子の卵管への到着は、イヌのように受精の2〜3日前に卵子が放出される種もあれば、コウモリのように排卵の6ヶ月前から精子が雌の生殖器に存在する種もあり、必ずしも同期したイベントではない（Holt、2011年）。 その結果、卵管環境は配偶子の生存と成熟に適した環境を提供していると推定される。

卵管は、異なる解剖学的領域（図2）と、発情周期中に生じる変化により動的である複雑な卵管液を持っているために異なる機能を発揮できる（Yañiz et al.2006; Leese et al.2008; Avilés et al.2010). この複雑さは、強力な分析装置の開発により、最近理解され始めている。 例えば、卵管液を生化学的に分析すると、数百のタンパク質（スポット）を同定することができる（図3）。 二次元電気泳動法を用いると、卵管液中に存在するさまざまなタンパク質（スポットの数と量）について、定性的・定量的な情報を得ることができる。 このような分析により、発情周期や配偶子の存在によるタンパク質の微妙な変化（リン酸化など）を検出することができる。 意外な結果としては、配偶子や胚の存在によって卵管内のトランスクリプトームが変化することが挙げられます（Fazeli et al.） 胚の発生段階（4細胞胚または胚盤胞）に応じてさらに特異的な変化が観察され、胚が子宮に到着する前でも子宮に影響を及ぼす免疫関連遺伝子のダウンレギュレーションが生じました（Almiñana et al, 2012）。 さらに、XまたはY染色体を持つ精子が存在する場合にも変化が検出された（Almiñana et al.、2014）。 卵管における遺伝子（トランスクリプトーム）およびタンパク質（プロテオーム）の発現は、いくつかの種で共有されているが、同一ではないため、一部の機能は保存されていると考えられるが、他のいくつかの特異的な性質は、それぞれの種に固有のものと思われる（Bauersachs et al, 2003, 2004; Tone et al, 2008; Mondéjar et al, 2012）。 このことは、異なる種に対する特異的な希釈液や培養液の開発のために考慮されるべきである。

配偶子の保護と生存

卵管液の存在が精子の生存率に良い影響を与えること（Killian，2011）、卵管は卵子の生存に必要な栄養素と卵管液中の抗酸化作用を持つ酵素を提供することが報告されている（Leese et al, 2008; Avilés et al.，2010）。 これらの酵素は、精子が細胞膜を修飾する活性酸素種（ROS）にさらされると容易に損傷し（タンパク質および脂質の過酸化）、DNAの切断につながるため、特に精子と関係が深い（Aitken and Luliis, 2010）。 さらに、女性生殖器内の精子は異物細胞とみなされ、免疫学的な監視により精子の生存に影響を与える（Kawano et al.、2014）。 このプロセスがどのように制御されているかはまだ解明されていないが、間違いないのは、卵管環境が精子を保護していることである。 その証拠に、精子は牛や母豚の場合1～2日、コウモリの場合6ヶ月まで卵管内で生存できる（Holt, 2011）。

卵管内での卵子の成熟

卵管内での卵子の寿命はヒトで約24時間と報告されており、これまで分析したほとんどの種で同様である。 しかし、イヌは特殊で、排卵時に卵巣から放出された卵子は未熟で、受精までに2～3日間卵管内に滞留して成熟する必要がある（筒井ら、2009）。 種によっては、体外受精（IVF）の効率がまだ低く、これは主にART技術の標準化が不十分なためである（Mondéjar et al.） しかし、in vivoとin vitroの受精効率の違いを説明するために、卵管での卵子の成熟に関連する2つの仮説が考えられる。 (i) 卵管で起こる事象は基本的なものではないが、in vitroの手順では起こらないため、最高品質の卵母細胞のみが生き残る。 これが、ARTにおける成功率がin vivoの事象と比較して低下する理由であろう。 (ii) 体外手順に使用される卵子は、生理的に卵管内で排卵・受精したものよりも質が低く、その結果、エピジェネティックマークなど、重要ではないが成熟期の健康にとって重要な特徴に変化がある胚が生じる (El Hajj and Haaf, 2013)． 卵管液中のいくつかのタンパク質は、卵丘の細胞外被である透明帯（ZP）と結合し、そのタンパク質と糖質の組成を変化させることができる。 そのため、卵管特異的糖タンパク質（OVGP1）、オステオポンチン、リポカリン型プロスタグランジンD合成酵素、ラクトフェリンが、異なる種のZPに結合することが証明された（Goncalves, et al.） OVGP1 は最も研究されている ZP 関連タンパク質であり、ブタの多精を減少させる受精前の ZP 硬化におけるその役割が実証されている (Coy et al., 2008)。

精子-ZP 結合および受精プロセス全般に関わるいくつかのメカニズム（多精の可能性を調節する）が、卵管によって調節されている。 受精前のZP硬化の場合、9種の卵子と5種の卵管液を用いた一連の実験により、卵巣卵子と卵管液の短時間インキュベーションにより、酵素消化に対するZP抵抗性に明確な変化が生じることが示された（Mondéjar et al.、2013年）。 しかし、得られた結果は同一ではなく、(i)卵管液のタンパク質組成の違い、あるいはOVGP1について実証されたように、オルソログ遺伝子によってコードされたタンパク質配列の違い(Avilés et al., 2010) または (ii) ZP組成（タンパク質と糖質；Stetson et al., 2012）に起因し得る特異性の度合いを示している。 種差の中には、ウマやラットのOVGP1のように、タンパク質が存在しないことに起因するものもあり得る。 さらに、ウマでは精子が卵子を受精させることができないが、ブタの卵管液や卵管タンパク質DMBT1とインキュベートすると、受精率が大幅に上昇する（Ambruosi et al, 6206>

卵管内の精子

精子は峡部で卵管上皮に付着する。 この結合により、排卵の時を待つ精子の貯蔵庫が形成される。 このような結合は、精子の生存率を維持するために重要なだけでなく、受精を損ない、あるいは妨げることになる早期の受精卵化を阻止するためにも重要である。 このリザーバーからの精子の放出は、卵丘-卵母細胞複合体（COC）によるシグナル、精子の結合を修正する卵管成分、さらにプロゲステロンとエストラジオールのレベルの変化、精子の過活性化運動などのさまざまな要因によって媒介されると考えられる（Suarez、2006、2008；Kölle et al, 6206>

射精時に放出された精子は卵子と受精することができず、受精プロセスを完了する能力を獲得する前に女性の生殖管に存在する必要がある。 精子が雌性生殖路で受けるさまざまな生物学的変化は受精能獲得と呼ばれ、Austin（1951）、Chang（1951）がウサギを動物モデルとして独自に発見したプロセスである。 このプロセスに関わる詳細な分子メカニズムは、主に卵管内で実際に何が起こっているかを確認することが困難なため、まだわかっていない。 精子に観察される変化は、タンパク質の再分配や放出によって生じる可能性があるが、他の要因も関与している可能性がある（Yanagimachi, 1994; Florman and Ducibella, 2006）。 精子が異なる卵管タンパク質（オステオポンチンとOVGP1）と結合することによって変化することが報告されており、一般に、いくつかの種において精子の生存率、運動性、および受精能が増加する（Kan et al, 2006; Killian, 2011）。 このように、OVGP1はZPと精子に結合するだけでなく、精子の受精能に関係するタンパク質のリン酸化を増加させることができる（Kanら、2006）。 ウシやブタの精子の受精能形成に関わるその他のメカニズムとしては、卵管液中の様々なグリコシダーゼの存在 (Carrasco et al., 2008) や卵管上皮の存在 (Ma et al., 2012) がある。 さらに、最近、受精能獲得時に精子細胞膜からシアリダーゼが放出されることが報告された(Ma et al., 2012)。 これらのグリコシダーゼは、精子の卵管上皮への結合を調節し、その結果、精子リザーバーからの放出も調節することができる。 ごく最近、精子が卵管を通過する間に小胞（エクソソーム）が媒介する特定の変化を引き起こす新しいメカニズムの存在が初めて報告された（Al-Dossary et al.） 遺伝子改変マウスを用いた最近の研究により、精子の受胎能力における雌性生殖管の関連性が強く立証された（Kawano et al.） このような改変マウスは不妊であるか、体外受精の技術を使って卵子を受精させることができない。 しかし、それらの遺伝子改変雄マウスは、生体内では受胎可能である。 その精子は、子宮分泌液と一緒に培養すると、体外受精で卵子と受精できることがわかったが、このプロセスは、上述のようにエクソソームが介在していると考えられる（Kawano et al.）

卵管における配偶子および胚の輸送

配偶子および胚は、適切な時期に適切な場所にいなければならず、そのため、卵管はこのプロセスに大きく寄与している。 精子が卵子と受精するためには、卵管膨大部まで到達する必要がある。 受精後、接合子と初期胚は子宮に運ばれ、胚盤胞が子宮内膜（子宮粘膜）に着床することが必要です。

卵子と胚の輸送

卵子と胚は不定形である。 卵子は排卵時に多数の細胞（卵丘細胞）に囲まれ、卵丘という構造を形成し、内槽に捕捉される（図2）。 精子のような移動能力はなく、受動的に運ばれる必要がある。 卵丘の膨張度のわずかな変化が、卵丘-卵母細胞複合体の内腔上皮への初期接着に影響を与え、さらなる輸送を妨げることが報告されている（Suarez, 2006）。 卵子の受精場所への輸送には、卵管の長さに沿った平滑筋細胞（筋層）の協調的収縮と、上皮細胞の繊毛運動という2つの重要な要素が関与している（図4）。 卵管収縮に変化が生じると、マウスでは卵子が受精部位に到達できなくなる（Dixon et al.） 胚と卵子は、雌馬とラットの卵管内で異なる速度で輸送される（Suarez, 2006）。 したがって、胚から産生されるプロスタグランジンE2がこのプロセスに関与していると考えられる。 最近では、胚が卵管の遺伝子発現の変化を誘発し、その結果、自らの環境を調節できることが報告されている(Almiñana et al., 2012)。

精子の輸送

射精時に放出される精子の数が多いにもかかわらず（4000万以上、37.ヒトとイノシシでそれぞれ4000万以上、37.5億）にもかかわらず、膨大な数の精子が尿膜に到達できず（ヒトで100-1000、イノシシで5000）、多くが廃棄されている（Harper, 1994; Hunter, 2012a; Suarez, 2006）。 受精部位に精子の数が少ないということは、卵子：精子の比率が1：1に近いということである。 精子の数が多いと多精化が進み、哺乳類の胚にとって致命的となるため、このことは重要である (Hunter, 2012a)。 精子が卵母細胞を見つける仕組みはまだわかっていない。 最近の研究では，精子は化学走性，温度走性によって受精卵に到達すると考えられている（Eisenbach and Giojalas, 2006; Hunter, 2012b）が，これは精子を卵管上部に誘導するプロセスであると考えられる． 卵丘細胞が産生するプロゲステロンを介した化学的勾配が関与していることが示唆されている（Eisenbach and Giojalas, 2006; Coy et al.） 変性した卵管卵子を産生するマウスは、in vivoでは受精しないが、これらの卵子はin vitroでは受精することから、この構造とin vivoの状況との関連性が示唆されている（Zhuo et al.） これらの研究は、卵丘の関連性を指摘するとともに、in vitroモデルで得られたデータは慎重に解釈する必要があることを思い起こさせる。さらに、in vivo環境をより正確に模倣したin vitroモデルの必要性を強調するものである。 しかし、現在までのところ、この点に関する進展は遅々としている。 精子が卵管に入るのは、子宮の筋収縮と化学走性または温度走性による精子の運動性に依存する比較的単純なプロセスであると予想される。 しかし、精子のタンパク質の一つ（例えば、ADAM3）が修飾されていると、精子は子宮卵管接合部を通過できないことが明らかになっている（岡部, 2013）。 精子と卵管の間にどのような分子間相互作用が存在し、精子が卵管に入ることができるのか、まだ解明されていない。

卵管環境の胚発生への影響

体外で胚を得ることができ、子宮内に自分の胚がないドナーでも胚移植後に妊娠が成立することから、卵管の役割を否定している。 しかし、卵管内で胚を培養した後に得られた胚盤胞の品質は、少なくとも形態、遺伝子発現、耐冷性、移植後の妊娠率において、体外生産胚と比較して優れていることが、異なる種で実証されている（Rizosら、2007；2010a；Mondéjarら、2012；Van Soomら、2014）。 このことから、卵管は単に子宮内を接合体・初期胚を輸送するための器官ではなく、両者の間にコミュニケーションがあることが実証された。 胚発生の最初の段階は、いくつかの種で観察される卵管長の大きな違いとは無関係に、胚が約4〜5日間を過ごす卵管内で起こる（図1と2bを比較; Suarez, 2006; Wang and Dey, 2006)。 この期間には、いくつかの重要なイベントが起こる。まず、切断過程と、母性ゲノムから胚性ゲノムへのスイッチオンがある。 これらのプロセスのいずれかに影響を与える培養環境の変更は、胚盤胞の品質に重大な影響を与える可能性がある（Lonergan et al.、2003a）。 最近、胚ゲノム活性化の前後を問わず、初期胚発生の特定の時点で培養条件をin vivoからin vitroへ、あるいはその逆へ変更することが、得られる胚盤胞の遺伝子発現パターンに決定的な影響を与えることが報告された（Gadら、2012年）。 さらに、体外培養条件が最適でない場合、胚の切断（細胞分裂）が阻害されること（マウスでは2細胞期、牛では8細胞期）が当初から観察されていた。 マウスでは、卵管タンパク質OVGP1を培養液に添加すると、胚発生のブロックが解除された（Yongら、2002）。 いくつかの実験的研究により、異なる種の卵管が同様の生物学的特性を持つことが示されており、これは類似のトランスクリプトームおよびプロテオームプロファイルと一致する（Mondéjar et al.） したがって、ヘテロログアッセイとして知られるプロセスにおいて、特定の種の卵管を、異なる種の胚の発達を改善するために使用することが可能である。 ウシ、マウス、ウサギ、およびヒツジの卵管は、多くの種からより質の高い胚を生産するために、異種または同種のin situ卵管での胚培養に使用されている（Rizosら、2002a、2010a；Lazzariら、2010）。 例えば、牛の場合、生体内では1つの胚しか発生しないが、体外では胚を集団で培養することでより高い胚盤胞発生率が得られる（Goovaerts et al.、2009）。 卵管内腔は繊毛で覆われ、卵管開口部に向かって拍動している。

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クラミジア感染によるマウス卵管のペースメーカー細胞喪失と卵子輸送阻害.

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