3.53.4.3 Syntetická fágová terapie
Bakteriofág, nebo jednoduše nazývaný fág, hrál ústřední roli ve vývoji molekulární biologie, bakteriální genetiky a poskytl první nástroje pro rekombinaci molekul DNA, jako jsou restrikční enzymy a ligázy. V posledním desetiletí vedlo studium mechnaismů rezistence fágů k objevu jedné z nejdůležitějších technologií umožňujících SB od dob PCR; jde o nukleázové systémy CRISPR, které se u bakterií a archeí vyvinuly jako adaptivní obrana proti exogenní DNA. Nedávná identifikace mnoha dalších dříve necharakterizovaných antifágových sytémů může poskytnout další průlomové technologie pro aplikace SB.45 V tomto historickém kontextu je tedy příhodné, že SB je nyní aplikována na fágy, aby se zdokonalilo jejich využití jako terapeutických látek.
Fágy byly objeveny nezávisle na sobě Frederikem Twortem a Félixem D’Hérellem na počátku 20. století46,47 a brzy poté byly sledovány jako antimikrobiální látky k léčbě infekčních onemocnění, jako je cholera a mor. Ve východní Evropě se fágová terapie stala běžnou a dodnes existuje několik renomovaných léčebných center, například v Gruzii a Polsku. Na Západě se fágová terapie po ojedinělých počátečních úspěších přestala používat, protože antibiotika se stala široce dostupnými. Dnes s nárůstem počtu patogenů rezistentních vůči antimikrobiálním látkám, zpočátku takzvaných kmenů ESKAPE48 , ale nyní ještě širšího souboru patogenů49 , které podle předpovědí způsobí do roku 2050 více úmrtí než rakovina, se zájem o fágovou terapii obnovil.
Použití fágů má oproti antibiotikům několik výhod, především možnost cílit na specifické kmeny, a tím ponechat prospěšné mikrobiální společenství nedotčené, a také možnost překonat rezistenci použitím doplňkových fágových koktejlů, „trénováním“ fágů na vybraných hostitelských kmenech nebo prostou izolací nových fágů proti patogenu. Naopak existuje několik překážek, které je třeba překonat, a oblastí, které je třeba zlepšit, aby se fágová terapie stala spolehlivým lékem a byla široce rozšířena na Západě, jako jsou silné klinické zkoušky s řádnými kontrolami, zkrácení doby pro identifikaci fágů s vhodným hostitelským rozsahem, překonání fágové rezistence a vylučovacích mechansimů cílového kmene bez potřeby složitých koktejlů, obejití nežádoucích imunitních reakcí na fágové částice a omezení generalizované transdukce genů rezistence vůči antibiotikům nebo faktorů bakteriální virulence. I v případě úspěšného usmrcení cílového kmene může rychlá lýza velkého množství bakterií a současné uvolnění endotoxinů a superantigenů vést k silné infamatorní reakci a nepříznivému klinickému výsledku.
Vysoce modulární organizace fágových genomů a sestavení fágové struktury jako funkčních modulů, jako jsou ocasní vlákna, hroty, ocasní trubice a kapsida, činí z fágů ideální cíle pro SB přístupy, v jistém smyslu jsou fágové genomy již uspořádány do BioBricks. V rané šabloně pro budoucí návrh syntetických fágů byl vláknitý fág Pf3 modifikován pro léčbu infekce Pseudomonas aeruginosa na myším modelu50. Gen exportního proteinu Pf3 byl nahrazen genem kódujícím restrikční endonukleázu BglII s odůvodněním, že (1) tato náhrada genu činí Pf3 nereplikativním, čímž se zavádí strategie zadržování, (2) fág lze stabilně množit v hostiteli obsahujícím gen pro metylázu BglII a (3) BglII by katalyzovala dvouřetězcové zlomy v genomické DNA cílového kmene pro usmrcení. Důležitým zjištěním této studie bylo, že léčba infikovaných myší upraveným fágem Pf3R nebo lytickým fágem poskytla srovnatelnou míru přežití u myší napadených mimimální letální dávkou 3, ale při minimální letální dávce 5 byla míra přežití výrazně lepší u fágové terapie Pf3R. Analýza hladin cytokinů v séru ukázala sníženou zánětlivou reakci, což naznačuje, že lepší výsledek u skupiny léčené fágem Pf3R je způsoben účinným usmrcením cílového kmene bez lýzy a uvolnění endotoxinu.
Usmrcení P. aeruginosa fágem Pf3R závisí na rozsahu hostitele, který zajišťuje specifičnost cílení, protože se očekává, že restrikční místa BglII budou přítomna v podstatě ve všech bakteriálních genomech. Zlepšení naznačuje pozoruhodný objev bakteriofága, který získal systém CRISPR/Cas z neznámého zdroje pro vlastní potřebu.51 Fágem kódovaný systém CRISPR/Cas je schopen získávat nové spacery a nukleáza CAS3 byla znovu zaměřena na chromozomální element, který jeho hostitel, Vibrio cholera, používá pro vrozenou imunitu. Po tomto objevu byl systém CRISPR typu II z bakterie Streptococcus pyogenes upraven do bakteriofága M13 s mezerníky pro zacílení sekvencí pro geny rezistence vůči antibiotikům a virulence v bakterii Escherichia coli, přičemž autoři tato zařízení označují jako nukleázy řízené RNA (RGN).52 Prokázání vynikající specifičnosti tohoto systému dokázala RGN diskriminačně usmrtit kmen nesoucí jednonukleotidový polymorfismus v DNA gyráze, který uděluje rezistenci vůči chinolonům. Dále v umělém konsorciu tří bakteriálních kmenů dokázaly usmrtit vybrané kmeny (400-20 000násobné usmrcení ve srovnání s kontrolou), zatímco ostatní členové konsorcia zůstali nedotčeni. Specifičnost zabíjení zprostředkovaného CRISPR/Cas by mohla rozšířit fágovou terapii nad rámec cílení na patogeny na přesnou modulaci lidského mikrobiomu, jehož složení se podílí na prognóze některých druhů rakoviny a dokonce neurologických poruch, jako je autismus, Parkinsonova choroba a Alzheimerova choroba, prostřednictvím osy střevo-mozek.
Ideální platforma syntetických fágů by mohla být taková, v níž je vazba na hostitele navržena tak, aby byla velmi široká, zatímco specifičnost cílení na kmeny zajišťuje užitečná zátěž CRISPR/Cas. Tímto způsobem by bylo možné fágy snadno nasadit k léčbě, aniž by bylo nutné pro každý patogen ad hoc izolovat novou platformu. Dále by široká škála hostitelů v kombinaci s maticemi CRISPR zaměřenými na několik genů rezistence vůči antibiotikům nebo virulence mohla umožnit použití presumptivní fágové terapie, tj. před identifikací patogenu. Strategie rozšíření hostitelského spektra zahrnují dopředné genetické screeny k identifikaci fágových receptorů a požadovaných hostitelských faktorů,53 dolování sekvencí proteinů vázajících receptory (RBP) fágů z bakteriálních genomů a restartování syntetických fágů, které by mohly například kódovat knihovny proteinů vázajících receptory RBP pro HTS.54,55 Maskování receptorů kapsidami lze překonat expresí enzymů hydrolyzujících exopolysacharidy56 a dalších enzymů k degradaci biofilmů57 , zatímco jiné mechanismy maskování a fázové variace v expresi receptorů lze překonat fágovým inženýrstvím s několika ocasními vlákny obsahujícími různé RBP nebo RBP na nekanonické vysoce konzervované cíle na povrchu buněk. Bakterie nasazují četné antifágové systémy, z nichž principiální je vrozená imunita restrikční modifikace a adaptivní imunita CRISPR/CAS, ale naopak i fágy proti nim vyvinuly četné strategie, jak tyto systémy překonat, např. používají nekanonické nukleotidy ve své DNA, mají méně restrikčních míst nebo hypermetylují své genomy a dodávají proteiny, které inhibují restrikční enzymy nebo posilují metylační enzymy hostitele.
Zde popsaná platforma syntetických fágů by zabránila potřebě fágových koktejlů, jejichž regulační schvalování může být složitější. Zbývající cíle pro fágové inženýrství jsou obecné pro mnoho biologických látek, jako je stabilita a reakce imunitního systému. Zejména fagocytární buňky jsou zodpovědné za odstraňování částic fágů z oběhového systému. Dlouhodobě cirkulující fágové mutanty byly získány technikou sériového pasážování58 a bylo zjištěno, že jsou mutovány v hlavním kapsidovém proteinu. Později vedla jediná změna aminokyseliny, rovněž v kapsidovém proteinu, zavedená přímou genetickou manipulací k 13 000 až 16 000násobnému zvýšení schopnosti fága zůstat v myším oběhovém systému59. Další parametry pro zlepšení fága jako terapeutického prostředku, jako je výroba, složení a způsob podání, pravděpodobně nespadají do působnosti aktivit SB, ale poznatky získané z předchozí práce s nativními fágy se uplatní i u fágů upravených SB.
V průběhu posledního desetiletí s obnoveným zájmem o fágovou terapii a sporadickými zprávami o úspěšných případech jednotlivých pacientů došlo k pokusům o provedení kontrolovaných klinických studií, jejichž výsledkem nebyly žádné významné nežádoucí účinky, ale účinnost stále nebyla důrazně prokázána. Bude vzrušujícím dalším článkem příběhu fágové terapie, který začal před více než 100 lety, až se do klinických zkoušek dostanou fágy upravené technologií SB.
.