Vlastnosti a detekce botulinum neurotoxinu
Klostridie produkují více typů proteinových toxinů než kterýkoli jiný rod mikroorganismů. Výjimečnou vlastností Clostridium botulinum je jeho schopnost syntetizovat neurotoxin mimořádné účinnosti. BoNT tvoří skupinu farmakologicky podobných toxinů, které se vážou na periferní cholinergní synapse a blokují exocytózu acetylcholinu na nervosvalových spojích. BoNT vznikají v potravinách, ve střevě a v kultuře jako progenitorové toxinové komplexy, které se skládají z botulinového neurotoxinu spojeného s netoxickými proteiny. Bylo prokázáno, že netoxické složky komplexů dodávají neurotoxinu stabilitu a zabraňují jeho inaktivaci trávicími enzymy ve střevě.
Diagnóza botulismu se obvykle provádí na základě posouzení klinických příznaků u pacientů a v případě epidemií přenášených potravinami na základě shlukování případů zahrnujících skupinu lidí, kteří jedli společnou potravinu. Při většině vyšetřování botulismu je hlavním cílem zjistit přítomnost BoNT, protože spory C. botulinum jsou široce rozšířené v životním prostředí a kontaminují mnoho potravin. Detekce BoNT v krvi, žaludečním obsahu a potravinách poskytuje potvrzení botulismu. Izolace C. botulinum z podezřelé potraviny, ze stolice kojenců s příznaky botulismu nebo z ran poskytuje podpůrný důkaz pro diagnózu botulismu. Ve většině případů však neposkytuje potvrzení, protože spory se nacházejí v potravinách a příležitostně ve stolici zdravých dospělých.
BoNT se přednostně zjišťuje pomocí biologického testu toxinu extrahovaného z potraviny nebo klinického vzorku. Extrakt se injikuje intraperitoneálně myším a zvířata jsou pravidelně pozorována, zda se u nich neprojevují typické příznaky botulismu, a to po dobu až čtyř dnů. V závislosti na množství přítomného BoNT jsou příznaky botulismu obvykle pozorovány během 4-24 h. Mezi charakteristické příznaky patří snížená pohyblivost zvířat, naježení srsti, dýchací potíže, kontrakce břišních svalů s morfologií „vosy“, po níž následují křeče a smrt. Zvířata vykazující tyto příznaky obvykle uhynou do 24-48 h. Zvířata, která uhynou dříve než za 2 h nebo po 48 h, je třeba považovat za zvířata, která podlehla jiným látkám než BoNT. Smrt způsobená BoNT se potvrdí neutralizací sérotypově specifickými antitoxiny.
Při biologickém testu na myších na BoNT z klinických vzorků a z některých potravin se často vyskytují komplikace. Častá jsou zejména úmrtí způsobená látkami, které nejsou interferenty botulinu. Těmto nespecifickým úmrtím lze obecně zabránit zředěním interferující smrtící látky na konečný bod, kdy smrt způsobí silnější BoNT. Příležitostně může být v analyzovaném vzorku přítomen více než jeden sérotyp BoNT a potvrzení by vyžadovalo neutralizaci směsí antitoxinů. U potravin nebo klinických vzorků může dojít k úmrtí bez botulinu v důsledku infekce nebo přítomnosti endotoxinů. Infekční agens lze odstranit membránovou filtrací nebo přidáním antibiotik do testovaného extraktu. Extrakty obsahující endotoxiny lze obvykle zředit na vhodnou konečnou hodnotu nebo lze endotoxiny odstranit adsorpcí. U extraktů z neproteolytických kmenů C. botulinum (skupina II) se toxicita zvyšuje aktivací proteázou, jako je trypsin. V některých potravinách může trypsin vytvářet toxické peptidy, a proto by reakce měla být po 30-60 minutách ukončena přidáním inhibitoru sójového trypsinu.
Vizibilní C. botulinum lze z potravin izolovat obohacením ve vhodném růstovém médiu, jako je vařený masoglukózový bujón nebo médium obsahující peptony, kvasničný extrakt a glukózu. C. botulinum má komplexní požadavky na živiny a pro svůj růst vyžaduje bohaté médium. Pro izolaci je často užitečné zahřát část potraviny nebo klinického vzorku na 80 °C nebo 60 °C, aby se vyselektovaly spory C. botulinum skupiny I a II. Příležitostně se k inaktivaci vegetativních buněk ve vzorcích potravin analyzovaných na přítomnost C. botulinum skupiny II používá 50% ethanol. Po obohacení se přítomnost BoNT zjišťuje pomocí biologického testu na myších, jak bylo popsáno dříve. Pro izolaci C. botulinum skupiny I z klinických vzorků byly použity selektivní izolační agary obsahující antibiotika včetně cykloserinu, sulfametoxazolu a trimetoprimu.
Pro detekci BoNT byla vyvinuta řada imunologických metod, ale většina z nich není tak citlivá jako biologický test na myších a jejich potenciální nevýhodou je také detekce biologicky neaktivních BoNT. Bylo dosaženo několika pokroků v enzymatických imunosorbentních testech (ELISA), které tyto nevýhody zmírňují, a je pravděpodobné, že ELISA bude použita jako doplněk myšího biologického testu, ale nenahradí ho.
.