Složení a struktura protilátek

K identifikaci protilátek jako proteinů v gama globulinové frakci séra došlo během prvních tří desetiletí dvacátého století. Výzkumy, které vedly k těmto závěrům, vyplynuly ze snahy zajistit lepší produkt pro séroterapii pacientů s infekčními chorobami.

V devadesátých letech 19. století byla zavedena léčba infekčních onemocnění protilátkami a v prvních desetiletích dvacátého století se sérumoterapie stala metodou volby u pacientů infikovaných mikroorganismy, jako jsou C. diphtheriae, C. tetani, S. pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae a streptokoky skupiny A (Casadevall, 1996). Kapitola 3 popisuje vývoj sérologie záškrtu a tetanu. Protilátky používané v těchto terapiích byly původně získány z koní, kterým byly injekčně aplikovány cílové patogeny a/nebo jejich toxiny. Dnes víme, že injekce cizího (koňského) séra člověku může vést k tvorbě protilátek namířených proti těmto cizím sérovým proteinům. Tyto nově vytvořené protilátky mohou vyvolat vlastní jedinečnou patologii charakterizovanou horečkou, kožní vyrážkou, bolestmi kloubů, srdečními abnormalitami a poruchou funkce ledvin. Tato konstelace příznaků se označuje jako sérová nemoc a je způsobena tvorbou komplexů antigen (koňské sérum) – protilátka (lidské protilátky) (kapitola 33). Tyto komplexy jsou následně zachyceny v malých krevních cévách, kde aktivují zánětlivou reakci.

Pokusy zvýšit účinnost koňských protilátek proti S. pneumoniae a současně snížit výskyt nebo závažnost sérové nemoci a dalších nežádoucích reakcí vedly k novým informacím o složení protilátek. Konkrétně Oswald Avery (1877-1955) prokázal, že aktivita protilátek proti S. pneumoniae je obsažena v globulinové frakci séra.

Avery, narozený v Halifaxu v Novém Skotsku, se v deseti letech přestěhoval s rodinou do New Yorku. Získal doktorát na Kolumbijské univerzitě a věnoval se výzkumné kariéře především v Rockefellerově institutu lékařského výzkumu (později Rockefellerova univerzita). Ačkoli začal svou kariéru jako imunochemik, Avery a jeho kolegové Colin MacLeod a Maclyn McCarty vytvořili obor molekulární biologie, když v roce 1944 prokázali, že genetická informace je tvořena DNA.

Avery frakcionoval koňské sérum působením různých koncentrací síranu amonného, což je běžně používaná metoda srážení proteinů ze séra. Tyto precipitáty vyhodnotil funkčně tak, že je injikoval myším, které byly naočkovány smrtelnou dávkou S. pneumoniae. Největší ochranu poskytovaly frakce, které se vysrážely 38-42 % síranu amonného. Tato frakce obsahovala globuliny a vylučovala albumin a euglobuliny. Globulinová frakce byla také nejaktivnější v aglutinačních a precipitačních testech in vitro (Avery, 1915).

Výsledků podobných Averyho výsledkům dosáhli další badatelé během následujících 20 let (Chickering, 1915; Fenton, 1931b). Tyto studie potvrdily, že protilátky jsou sérové globuliny s molekulovou hmotností podobnou ostatním globulinům. V důsledku toho Michael Heidelberger v roce 1937 dospěl k závěru, že „je obecně přijímáno, že protilátky jsou modifikované sérové proteiny“ (Heidelberger a Pedersen, 1937).

Heidelberger (1888-1991), organický chemik, získal vzdělání na Kolumbijské univerzitě a Spolkovém polytechnickém institutu v Curychu. Ve svém výzkumu se zaměřil na izolaci a charakterizaci polysacharidů ze S. pneumoniae a na vývoj technik pro měření interakcí antigen-protilátka. Heidelberger provedl rozsáhlé studie s cílem určit optimální metody precipitace antigenu protilátkou; tyto studie se staly základem kvantitativního precipitačního testu. Na základě svých studií o vazbě protilátek je Heidelberger často považován za otce oboru kvantitativní imunochemie.

V polovině 30. let 20. století byla identifikace a charakterizace krevních proteinů vzrušující novou oblastí studia. Arne Tiselius (1902-1971) vystudoval chemii na univerzitě ve švédské Uppsale. Původně spolupracoval s Theodorem Svedbergem (1884-1971), který používal ultracentrifugaci k separaci koloidů včetně proteinů. Svedberg si uvědomil, že bílkoviny lze separovat také podle migračních vzorců v elektrickém poli, a navrhl Tiseliusovi, aby se zaměřil na vývoj technologie pro tento nový obor. V roce 1930 Tiselius popsal elektroforetickou separaci proteinů a na základě této práce získal titul doktora věd.

Tiselius (1937a,b) elektroforézou separoval sérum a prokázal čtyři složky s různým elektrickým nábojem. Tyto složky byly identifikovány jako albumin a tři globulinové frakce: alfa, beta a gama (obrázek 11.2). Na základě této charakterizace sérových proteinů obdržel Tiselius v roce 1948 Nobelovu cenu za chemii „za výzkum elektroforézy a adsorpční analýzy, zejména za objevy týkající se komplexní povahy sérových proteinů.“

Obrázek 11.2. Elektroforetické vzorce séra králíka, kterému byl podán vaječný albumin obsahující ovalbumin specifické protilátky. Sérum bylo možné rozdělit na čtyři frakce na základě elektroforetické pohyblivosti: albumin, alfa globuliny, beta globuliny a gama globuliny.

Z Tiseliuse a Kabata (1939).

Elvin Kabat (1914-2000) se připojil k Tiseliusově laboratoři poté, co získal doktorát za práci vykonanou v Heidelbergerově laboratoři. Kabat, získal bakalářské vzdělání na City College of New York a doktorát získal na Columbia University. Kabatova doktorská práce byla zaměřena na protilátkovou odpověď na pneumokokové polysacharidy. Prokázal, že protilátky, které aglutinují S. pneumoniae, mohou také precipitovat polysacharid izolovaný z bakterie (Heidelberger a Kabat, 1936). Když přijel do švédské Uppsaly pracovat do Tiseliusovy laboratoře, Kabat přivezl vzorek koňského séra, které obsahovalo protilátky proti pneumokokovým polysacharidům. Tiselius a Kabat analyzovali toto sérum elektroforézou a prokázali, že většina protilátkové aktivity migruje s gama globulinovou frakcí (Tiselius a Kabat, 1939).

Během následujících 15 let charakterizovalo molekuly protilátek několik dalších imunochemiků a bylo dosaženo všeobecné shody, že jsou hlavní složkou gama globulinové frakce séra. Toto poznání připravilo půdu pro další významný pokrok v oboru, který vedl k podrobné analýze molekulární struktury protilátek a vývoji modelu čtyř řetězců (obrázek 11.1). Tyto studie umožnily nahlédnout do vztahu mezi strukturou a biologickými funkcemi molekuly

.