Následující podrobné vysvětlení sérologických testů na celiakii napsal Tom Ryan, specialista technických služeb, INOVA Diagnostics, Inc.

V poslední době se hodně diskutuje o sérologických testech na celiakii, konkrétně o testování tTG (tkáňové transglutaminázy). Pokusím se odpovědět na některé z mnoha otázek, které se na tomto seznamu objevily ohledně všech testů. Zaprvé, a to platí pro všechny krevní testy, aby byly testy přesné, musíte v současné době držet dietu obsahující lepek. Protilátky jsou produkovány imunitním systémem v reakci na látky, které tělo vnímá jako ohrožující. Imunitní reakce, kterou vaše tělo produkuje, je jeho odpovědí na vystavení lepku ve stravě a jeho následný vliv na střevní sliznici. Pokud se ve stravě lepek nevyskytuje, nedochází k žádné reakci, kterou bychom mohli měřit. Krátká změna stravy nebude mít znatelný účinek. Pokud jste bez lepku zhruba týden, nebude to znamenat žádný velký rozdíl. Reakce může být nepatrně menší, ale rozdíl je zanedbatelný, protože tělo nemělo čas na změnu reagovat. Naopak, pokud jste bez lepku delší dobu a rozhodnete se nechat otestovat, krátká výzva trvající několik týdnů nestačí k vyvolání reakce a získání přesného testu.

Vytvoření imunitní reakce probíhá v několika krocích a trvá nějakou dobu, než dojde k pozitivní reakci, když je lepek přítomen, i k odstranění protilátek, když je lepek vyloučen. O tom, jak velká a jak dlouhá by měla být výzva, se vedou rozsáhlé diskuse a nepanuje shoda. Poraďte se se svým lékařem. Můj osobní pocit je, že minimum jsou 2 krajíce chleba denně po dobu 6 týdnů, aby byl test přesný, ale nesnažila bych se lékaře odhadovat. V zásadě existují čtyři testy, které lze provést jako pomoc při diagnostice celiakie. Všimněte si, že říkám, že pomohou při diagnostice celiakie. Imunologie je poměrně přesná, ale zdaleka to není exaktní věda. Všechny laboratorní testy, bez ohledu na typ nebo zdroj, jsou uváděny jako pomůcky k diagnostice. Neměly by být používány samostatně jako základ pro stanovení diagnózy, ale spíše by měly být zváženy ve spojení s fyzikálním vyšetřením pacienta, jakož i s uváděnými příznaky atd. vyškoleným lékařem. Došlo k mnoha nejasnostem ohledně toho, co tyto testy představují, a já doufám, že se mi podaří některá nedorozumění zmírnit. Existuje mnoho termínů, které slýcháme. tTG, IgA, IgG, ELISA atd. Co to všechno je? Někteří přispěvatelé do seznamu odkazují na test IgA nebo IgG nebo na test ELISA. Tato označení jsou pro naše účely neúplná a mohou odkazovat na libovolný počet různých testů.

Všichni máme v těle rodinu blízce příbuzných, i když ne identických bílkovin, které jsou schopny působit jako protilátky. Ty se souhrnně označují jako imunoglobuliny. U dospělého člověka je běžně přítomno pět hlavních typů imunoglobulinů. Jsou to IgG, IgA, IgM, IgE a IgD. Každý z nich je zkratkou pro zápis imunoglobulinu gama G (nebo A či M atd.) a každý z nich plní v našem systému jinou funkci. IgG je hlavní imunoglobulin v lidském séru. Je důležitý pro zajištění imunity u vyvíjejícího se plodu, protože projde přes placentární bariéru. IgA je hlavním imunoglobulinem v sekretech z dýchacích a střevních sliznic. IgE je gama globulin produkovaný buňkami vystýlajícími střevní a dýchací cesty. Vytváří protilátky spojené s většinou hypersenzitivních (alergických) reakcí. Je spojován s astmatem, sennou rýmou atd. IgM je globulin, který se tvoří téměř při každé imunitní reakci v počáteční části reakce. IgD je vzácný protein přítomný v normálním séru v nepatrném množství. Tato označení odkazují na typ bílkoviny, která je nositelem dané protilátky. Vznikají jak podtypy IgG, tak IgA protilátek proti gliadinu, proto je označujeme jako IgG gliadin nebo IgA gliadin. Souhrnně se jedná o antigliadinové protilátky.

Antigliadinové protilátky:

V séru pacientů s gluten senzitivní enteropatií (celiakií) jsou detekovány jak IgA, tak IgG antigliadinové protilátky (AGA). IgG antigliadinové protilátky jsou citlivější, ale jsou méně specifickými markery onemocnění ve srovnání s protilátkami třídy IgA. Protilátky proti gliadinu třídy IgA jsou méně citlivé, ale specifičtější. V klinických studiích mají protilátky třídy IgA specifičnost 97 %, ale senzitivita je pouze 71 %. To znamená, že pokud je pacient IgA pozitivní, existuje 97% pravděpodobnost, že má celiakii. Naopak, pokud je pacient IgA negativní, existuje pouze 71% pravděpodobnost, že je pacient skutečně negativní na celiakii. Pozitivní výsledek je tedy silnou indikací, že pacient nemoc má, ale negativní výsledek nemusí nutně znamenat, že ji nemá. Falešně pozitivní výsledky jsou spíše výjimečné, ale falešně negativní výsledky se mohou vyskytnout. Na druhou stranu protilátky IgG proti gliadinu jsou 91 % specifické a mají 87 % citlivost. To znamená, že se u nich pozitivní výsledky projeví snadněji, ale není zde tak silná korelace s celiakií. Je méně specifická. Pacienti s jinými onemocněními, ale nepostižení celiakií, budou občas vykazovat pozitivní výsledky. IgG antigliadinové protilátky jsou detekovatelné přibližně u 21 % pacientů s jinými gastrointestinálními poruchami. Tento test může poskytnout falešně pozitivní výsledky, ale je méně pravděpodobné, že poskytne falešně negativní výsledky.

Senzitivní testovací protokol zahrnuje testování IgA i IgG antigliadinových protilátek, protože významná část pacientů s celiakií (přibližně 2-5 %) má nedostatek IgA. Tento kombinovaný test na antigliadinové protilátky IgA a IgG má celkovou citlivost 95 % a specifičnost 90 %. Typ testu používaný k detekci antigliadinových protilátek se nazývá ELISA. Jedná se o zkratku, která znamená Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay. ELISA není test sám o sobě. Jedná se o metodu testování, jejíž provedení je poměrně jednoduché. Zahrnuje vložení odměřeného množství zředěného séra pacienta do jamek speciálně zkonstruované a připravené destičky a jeho inkubaci po určitou dobu s různými chemickými látkami. Konečným výsledkem je barevná změna, jejíž intenzita závisí na koncentraci antigliadinové protilátky (nebo jiného měřeného proteinu) v séru pacienta. Schopnost tohoto barevného roztoku absorbovat světlo o určité vlnové délce lze změřit na laboratorním přístroji a matematicky porovnat s roztoky, které obsahují známé množství antigliadinové protilátky, a získat tak číslo pro množství přítomné protilátky. Vzorek pak lze klasifikovat jako negativní (0-20 jednotek), slabě pozitivní (21-30 jednotek) nebo středně až silně pozitivní, pokud je vyšší než 30 jednotek. Účelem testování na antigliadinové protilátky je kromě diagnostiky gluten senzitivní enteropatie také sledování dodržování bezlepkové diety. Množství IgA gliadinových protilátek se rychle zvyšuje v reakci na lepek ve stravě a rychle klesá, když lepek ve stravě chybí. Protilátky IgA proti gliadinu mohou při bezlepkové dietě zcela vymizet během 2-6 měsíců, takže jsou užitečné jako kontrola diety. Naproti tomu IgG antigliadinové protilátky potřebují dlouhou dobu, někdy i více než rok, aby byly negativní. Platí to i obráceně. To znamená, že pacient s celiakií, který drží bezlepkovou dietu a jehož testy na IgA antigliadinové protilátky jsou negativní, vykáže rychlý nárůst tvorby protilátek, když je vyzván lepkem ve stravě. Přibližně u 90 % pacientů, u kterých byl lepek vyzván, se během 14-35 dnů po výzvě objeví pozitivní výsledek IgA antigliadinových testů. Protilátky IgG jsou poněkud pomalejší.

Endomysiální protilátky:

Antiendomysiální protilátky třídy IgA (AEA) jsou velmi specifické, vyskytují se pouze u celiakie a DH. Tyto protilátky se vyskytují přibližně u 80 % pacientů s DH a v podstatě u 100 % pacientů s aktivní celiakií. Endomyziální protilátky IgA jsou pro diagnostiku celiakie citlivější a specifičtější než gliadinové protilátky. Zjistilo se, že titry (ředění) protilátek jsou paralelní s morfologickými změnami v jejunu a lze je také použít k vyjádření dodržování bezlepkové diety. Titry se snižují nebo jsou negativní u pacientů na bezlepkové dietě a znovu se objevují při výzvě k podání lepku.

Test na antiendomysiální protilátky je subjektivnější a pro laboratoř složitější než testy na antigliadin. Zahrnuje sériové ředění části pacientova séra, tj. ředění o ½, pak o ¼, 1/8, 1/16 atd. a umístění těchto ředění na podložní sklíčko, na kterém je připevněna nějaká tkáň. Sklíčko se pak zpracuje různými roztoky a zkoumá se pod fluorescenčním mikroskopem, aby se zjistilo, zda se sérum váže na některý z proteinů ve tkáni. Pokud ano, potvrdí se, že pacient má protilátky proti danému proteinu. Tato metoda testování se nazývá IFA nebo někdy IIFA. Jedná se o zkratku pro Indirect Immuno-Fluorescent Assay. Výběr tkáňového preparátu, který se použije, je určen tím, jaký konkrétní protein, tedy jakou protilátku, konkrétně hledáte. Endomysiální protilátky reagují s endomysiem, což je obal z retikulárních vláken, který obklopuje každé svalové vlákno. Proto byste k detekci endomysiálních protilátek měli použít tkáňový substrát, který obsahuje hodně svalové tkáně. Substrátem, který se pro tento test používá nejčastěji, jsou distální úseky jícnu. Ty se nakrájejí na velmi tenké plátky a upevní na podložní sklíčko. Obsahují svalová vlákna a ne mnoho jiného, takže je v nich k dispozici velké množství endomysia, které může reagovat s protilátkami proti endomysiu.

Vyšetření tohoto testu zahrnuje prohlížení reagujících preparátů fluorescenčním mikroskopem, aby bylo možné provést stanovení. To vyžaduje vysoce kvalifikované a vyškolené oko a je z nutnosti poněkud subjektivní. Hledá se zelená fluorescence v endomysiu pokrývajícím svalová vlákna. Test se uvádí jako titr nebo konečné ředění, ve kterém je fluorescence stále jasně viditelná. Jak si dokážete představit, je to velmi subjektivní. Neexistují žádné standardizované hodnoty a záleží na posouzení konkrétního technika, jaký je konečný titr. Nedávno (1998) byl endomysiální antigen, na který se zaměřují antiendomysiální protilátky, identifikován jako proteinový zesíťující enzym známý jako tkáňová transglutamináza (tTG). To umožnilo výrobu antigenně specifického testu ELISA obsahujícího tTG jako spolehlivé a objektivní alternativy k tradičním a subjektivním testům založeným na imunofluorescenci. V klinických studiích byla prokázána téměř 100% korelace s endomysiálním IFA testem. Jedná se o test, který byl v odborné komunitě velmi dobře přijat. Jedná se o test ELISA, stejně jako test na antigliadinové protilátky, a proto nepodléhá interpretaci jako test IFA. To je největší výhoda tohoto nového testu! U tohoto testu nebo jakéhokoli jiného testu ELISA se reakce měří na přístroji, který vypočítá množství světla určité vlnové délky, které je roztokem absorbováno, a vypíše číselný výsledek. Neexistuje žádná možnost zkreslení výsledků lidskou chybou, protože se nejedná o žádný úsudek. Destička ELISA, bez ohledu na to, na co se testuje, se zpracovává s nejméně třemi kontrolními séry (někdy až s osmi) kromě testovaného neznámého vzorku. K dispozici je negativní sérum a nejméně dvě pozitivní séra obsahující různé hladiny testované protilátky. Existují specifické požadavky na absorpční hladiny těchto tří kontrol. To znamená, že každá z nich má minimální nebo maximální (nebo obojí) počet, který musí přístroj zaznamenat, aby se jednalo o platný test. Pokud se objeví jakákoli odchylka od těchto očekávaných čísel, je to známka toho, že se něco pokazilo, a výsledky testu se vyřadí a test se opakuje. Není tedy možné, aby technik hlásil nepřesné výsledky (za předpokladu, že vzorek správně naředil). Buď byl test platný a můžete se spolehnout na přesnost výsledku, nebo je test neplatný a celý výsledek se vyřazuje. Pokud by došlo k jakékoli chybě při zpracování destičky ELISA, vedlo by to k tomu, že by čísla kontrolních sér byla mimo rozsah a celý výsledek testu by byl vyřazen.

Shrnem lze říci, že tTG ELISA měří totéž, co endomysiální IFA, ale metodou, která je citlivější a specifičtější a nepodléhá interpretaci. Retikulinové protilátky třídy IgA se vyskytují pouze u celiakie a dermatitis herpetiformis. Tyto protilátky se vyskytují přibližně u 60 % pacientů s celiakií a 25 % pacientů s DH. Tento test se přestává používat z důvodu omezené užitečnosti a dostupnosti lepších testů. Jedná se o IFA prováděný na tkáňovém substrátu se všemi doprovodnými problémy, které s tím souvisejí. Vývoj všech těchto sérových testů nesmírně zjednodušil diagnostiku celiakie a zvýšil i její přesnost. Původní kritéria pro stanovení diagnózy podle Evropské společnosti pro dětskou gastroenterologii a výživu (ESPGAN) zahrnovala rok náročných studií s:

• Počáteční pozitivní střevní biopsií;
• 6 měsíců na bezlepkové dietě;
• Druhou, negativní střevní biopsií;
• Výzvou na lepek po dobu 6 měsíců a;
• Třetí, pozitivní střevní biopsií. Revidovaná kritéria ESPGAN vyžadují pozitivní výsledky dvou sérologických testů potvrzené jednou pozitivní biopsií. V praxi mnoho gastroenterologů využívá sérologické testy ve spojení s kontrolovanou dietou a klinickým obrazem k vytvoření základu pro diagnózu bez nutnosti invazivního zákroku.

Pod záštitou Nadace pro celiakii a dalších organizací bylo začátkem tohoto roku v Marina Del Rey v Kalifornii uspořádáno odborné sympozium a workshop s účastníky z Evropy i USA s cílem stanovit standardy pro hlášení výsledků testů. To by mělo ještě více zlepšit testování a diagnostiku. Na závěr této konference byl vytvořen Výbor pro standardizaci celiakie, jehož úkolem je prozkoumat a vydat doporučení ohledně standardizovaného způsobu hlášení výsledků

.