Abstrakt
Zkoumali jsme účinky léčby síranem vanadičným (VOSO4) v dávce 5 a 10 mg/kg po dobu 30 dnů na aktivitu a histologii endokrinního pankreatu u nediabetických a diabetických potkanů indukovaných STZ. U diabetické skupiny se významně zvýšila hladina glukózy v krvi, zatímco hladina inzulinémie se výrazně snížila. Na konci léčby VOSO4 v dávce 10 mg/Kg normalizoval hladinu glukózy v krvi u diabetické skupiny, obnovil inzulinémii a významně zlepšil citlivost na inzulin. VOSO4 také v závislosti na dávce zvýšil počet inzulin imunopozitivních beta buněk v pankreatických ostrůvcích nediabetických potkanů. U STZ-diabetické skupiny byl navíc pokles počtu inzulín imunopozitivních beta buněk korigován tak, aby dosáhl kontrolní úrovně především vyšší dávkou vanadu. Léčba VOSO4 tedy normalizovala hladinu glukosy a inzulinu v plazmě a zlepšila citlivost na inzulin u STZ-experimentálního diabetu a indukovala proliferaci a/nebo regeneraci beta buněk u normálních nebo diabetických potkanů.
1. Úvod
Vanad je přechodný kov. Odhaduje se, že v důsledku lidské činnosti se ročně do ovzduší uvolní více než 60 tisíc tun tohoto prvku převážně při spalování fosilních paliv .
Po vstupu do oběhového systému gastrointestinálním nebo respiračním traktem jsou sloučeniny vanadu transportovány transferinem nebo méně často albuminem nebo nízkomolekulárními složkami plazmy, jako jsou citráty a v menší míře laktáty nebo fosfáty . Bylo provedeno mnoho studií s anorganickými a organickými deriváty vanadu na zvířecích modelech indukovaného diabetu, v nichž bylo zjištěno, že studované sloučeniny ovlivňují hladiny glukózy, cholesterolu a triglyceridů, přičemž při dlouhodobém podávání neměly žádné významné škodlivé vedlejší účinky . Bylo také provedeno mnoho pokusů na diabetických pacientech, které potvrdily terapeutický účinek sloučenin vanadu na hladinu glukózy v krvi s malými toxickými účinky .
Bylo prokázáno, že vanad (včetně vanadylu a vanadičnanu) snižuje hladinu glukózy v krvi stimulací glykogeneze, příjmu a metabolismu glukózy a inhibicí tvorby glukózy prostřednictvím jaterní glukoneogeneze a glykogenolýzy . Bylo zjištěno, že vanad a jeho sloučeniny vykazují inzulinu podobnou aktivitu tím, že napodobují působení inzulinu prostřednictvím aktivace inzulin-receptorové tyrosinkinázy a kaskády kinázové fosforylace . Proto byl vanadylsulfát navržen jako terapeutický prostředek pro léčbu diabetu 1. typu . Léčba streptozotocinem (STZ) ničí beta buňky slinivky břišní produkující inzulin a STZ indukované diabetické krysy jsou považovány za model diabetu mellitu 1. typu . Ačkoli bylo prokázáno, že sloučeniny vanadu mají antidiabetické vlastnosti u modelu diabetu vyvolaného STZ, mechanismus jejich účinku zůstává v současné době předmětem zkoumání. Cílem této studie bylo prozkoumat reakce na 30denní léčbu síranem vanadičitým u nediabetických a STZ indukovaných diabetických potkanů.
2. Materiály a metody
2.1. Příprava diabetických potkanů
Zvířata byla diabetická intraperitoneální injekcí (ip) STZ v jednorázové dávce 65 mg/Kg v 0,01 M citrátovém pufru (pH 4,5). Tato ip metoda byla zvolena na základě nedávných zpráv, které prokázaly výrazný účinek zvyšující hladinu glukózy u STZ-diabetických potkanů .
2.2. Zvířata a léčba
Samci potkanů Wistar, 5-6 týdnů staří (o hmotnosti 175-200 g), byli zakoupeni v Pasteurově ústavu v Tunisku a použiti v souladu s místní etickou komisí Tuniské univerzity pro používání zvířat a péči o ně v souladu s doporučeními NIH. Dostávali potravu (standardní granulovanou stravu – Badr Utique-TN) a vodu ad libitum a byli umístěni po pěti v každé kleci při sběrné teplotě (22 °C) a 12hodinovém cyklu světlo-tma. Potkani byli rozděleni do šesti skupin.
Skupinu 1 tvořila nediabetická kontrolní zvířata (ND kontrola) a denně dostávala intraperitoneální injekci (ip) NaCl 9. Skupina 2 byla rozdělena do dvou skupin. Skupiny 2 a 3 byly ND a dostávaly denně dávku 5, resp. 10 mg VOSO4/Kg (ND + 5 mg/Kg a ND + 10 mg/Kg) po dobu 30 dnů. Skupina 4 byla kontrolní diabetická skupina (D kontrola), které byla aplikována jednorázová dávka 65 mg/Kg STZ. Skupiny 5 a 6 tvořila zvířata s diabetem STZ, kterým bylo podáváno buď 5, nebo 10 mg/Kg VOSO4 po dobu 30 dnů (D + 5 mg/Kg, D + 10 mg/Kg). STZ-skupiny byly léčeny VOSO4 po 48 hodinách STZ-indukovaného diabetu.
2.3. Biochemické testy
Všechna zvířata byla před stanovením glykémie pomocí glukometru (ACCU-CHEK-Active Roche) 12 hodin nalačno. Citlivost na inzulín byla měřena po ip injekci 1 U/Kg inzulínu a hladina glukózy v krvi byla stanovena v 30minutových intervalech během 2 hodin jako procento hladiny hormonu při .
Zvířata byla usmrcena po 24 hodinách od posledního ošetření a byla jim odebrána krev a sérum bylo zpracováno pro stanovení inzulínu, který byl stanoven pomocí soupravy Elisa (distribuované firmou BioVendor).
2.4. Zvířata byla usmrcena po 24 hodinách od posledního ošetření. Imunohistochemické hodnocení
Imunohistochemické barvení inzulinu bylo provedeno za účelem charakterizace integrity beta buněk v Langerhansových ostrůvcích. Za tímto účelem byly pro srovnání mezi skupinami vybrány tkáňové řezy zobrazující maximálně větší povrch Langerhansových ostrůvků. Řezy byly nejprve deparafinovány, hydratovány postupně se snižující sérií ethanolu, ponořeny do tamponového citrátu (pH 6) na 40 minut a poté inkubovány s polyklonální protilátkou proti inzulínu morčete zředěnou v 50 mM Tris-HCl, pH 7,6 (DAKO). Po promytí byly řezy inkubovány s protilátkou proti morčeti konjugovanou s fosfatázou a postup odhalování byl asistován přístrojem TechMate 500. Nakonec byly řezy obarveny hematoxylinem/eosinem.
Deset pankreatických ostrůvků na potkana bylo vyšetřeno pod mikroskopem a počet inzulin-pozitivních a inzulin-negativních buněk byl spočítán očíslováním jejich jader. Údaje jsou vyjádřeny jako procento inzulín imunopozitivních buněk/celkový počet buněk v každém ostrůvku.
2.5. Inzulín pozitivní buňky v jednotlivých ostrůvcích. Statistická analýza
Významnost rozdílů mezi jednotlivými skupinami byla hodnocena pomocí jednosměrné analýzy rozptylu (ANOVA) s následným Tukeyho testem mnohonásobného porovnání a hodnota byla považována za významnou na úrovni
3. Výsledky
Vliv léčby VOSO4 na hladinu glukózy v krvi u nediabetických (ND) a diabetických (D) potkanů je znázorněn na obrázku 1. Vliv léčby VOSO4 na hladinu glukózy v krvi je znázorněn na obrázku 2. U kontrolní skupiny ND nedošlo během léčby k žádným významným změnám hladin glukózy v krvi (Obrázek 1(a)). Při léčbě ND potkanů přípravkem VOSO4 v dávce 5 nebo 10 mg/Kg se hladiny glukózy v krvi během prvních 10 dnů významně nezměnily. Hladina glukózy v krvi se však významně snížila na konci léčby dávkou 5 mg/Kg a od 15. do 30. dne se významně snížila u dávky 10 mg/Kg ve srovnání s kontrolní skupinou ND. Ve 30. dni byl pokles glykémie u dávek 5 a 10 mg/Kg ve srovnání s kontrolní skupinou přibližně 8, resp. 15 %. Jak se předpokládalo, u kontrolních potkanů léčených STZ bylo pozorováno nápadné zvýšení hladiny glukózy v krvi ve srovnání s neléčenými zvířaty ( versus mg/dl), což svědčí o instalaci diabetu, která se udržovala po celou dobu experimentu. Léčba diabetické skupiny (D) dávkou 5 mg/Kg VOSO4 významně snižovala hladinu glukózy v krvi od 10. dne, zatímco dávka 10 mg/Kg snižovala hladinu glukózy v krvi významně a postupně od 5. dne až do dosažení normální hladiny ve 30. dni. Zaznamenané hodnoty glykémie ve 30. dni byly a versus mg/dl, respektive ve skupinách D + 5, D + 10 a kontrolní D (obrázek 1b).
Tabulka 1 ukazuje hladiny inzulínu ve skupinách ND a D bez léčby a po léčbě VOSO4. U potkanů ND léčených 5 mg/Kg VOSO4 nedošlo k významným změnám v hladině inzulinémie, ale při léčbě 10 mg/Kg došlo k jejímu výraznému zvýšení ve srovnání s kontrolní skupinou ND ( versus µg/l). Navíc u kontrolní skupiny D došlo k hlubokému snížení inzulinemie ve srovnání s kontrolními zvířaty ND ( versus µg/L). Podávání VOSO4 u skupin D výrazně zvýšilo inzulinémii v závislosti na dávce. Ve skutečnosti se hladiny inzulinu u diabetických potkanů zvýšily z na a µg/L při dávkách 5 mg, resp. 10 mg/Kg.
Změny citlivosti na inzulin po ip injekci inzulinu (1 U/Kg) u normálních a diabeticky léčených zvířat jsou znázorněny na obrázku 2. U potkanů s ND léčba 10 nebo 5 mg přípravku VOSO4 nezměnila profil glykémie v reakci na podání inzulínu (obrázek 2 a)). U těchto skupin byl totiž maximální hypoglykemizující účinek inzulinu pozorován do 60, resp. 90 min a činil přibližně počáteční hodnotu glykémie. Diabetická zvířata léčená nízkou dávkou VOSO4 vykazovala podobný profil glykémie jako kontrolní skupina D s maximálním poklesem do 60 min, zatímco zvířata léčená vysokou dávkou vykazovala významný () a rychlý maximální pokles glykémie do 30 min po podání inzulínu (obr. 2(b)).
Ve skupinách léčených VOSO4 byla pozorována větší velikost pankreatických ostrůvků ve srovnání s jejich příslušnými kontrolními skupinami ND a D (obr. 3 a 4). Statistické analýzy ukázaly, že léčba VOSO4 vyvolala výrazné zvýšení počtu inzulín imunopozitivních buněk přibližně o 20 % ve skupinách ND + 5 a 27 % ve skupinách ND + 10 mg/Kg (obr. 5). Léčba VOSO4 významně zvýšila počet inzulin imunopozitivních buněk u STZ-diabetických skupin v závislosti na dávce, a to o 12 % u ND a o 23 % u ND + 10 mg/Kg (obr. 5). Srovnání mezi skupinami léčenými STZ-diabetiky a kontrolními ND potkany neukázalo žádné významné rozdíly.
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c).
Imunohistochemické barvení inzulínu v Langerhansových ostrůvcích beta buněk pankreatu z STZ-diabetických potkanů. Všimněte si, že u léčených STZ-diabetických potkanů je více inzulín imunopozitivních buněk než u neléčených STZ-diabetických potkanů. Kontrolní D (a), D léčený 5 mg/Kg VOSO4 (b) a D léčený 10 mg/Kg VOSO4 (c). Analyzováno bylo deset ostrůvků na potkana. Měřítko: 50 µm.
Vliv vanadylsulfátu na počet beta buněk v %. Hodnoty představují průměr ± SD. ; versus kontrola ND. ; versus kontrola D. versus D + 5 mg/Kg. Analyzováno bylo 10 ostrůvků na potkana.
4. Diskuse
Studovali jsme antidiabetické vlastnosti vanadu zkoumáním jeho účinků na hladinu glukózy a inzulínu v krvi a na B buňky endokrinního pankreatu.
Při použití STZ indukovaných diabetických potkanů jsme prokázali, že léčba vanadylsulfátem (VOSO4) v dávce 5 a 10 mg/Kg významně snížila průměrnou hladinu glukózy v krvi 10., resp. 5. den ve srovnání s neléčenou kontrolní skupinou. Ve 30. dni vykazovali diabetičtí potkani, kterým byla podána vyšší dávka sloučeniny, podobnou hladinu glykémie jako kontrolní zvířata ND. U ND potkanů však léčba nižší dávkou VOSO4 hladinu glukózy v krvi významně nezměnila, zatímco vyšší dávka vyvolala malý a postupný pokles do 15. dne léčby a ve 30. dni se glykémie snížila přibližně o 14 %. Naše výsledky jsou v souladu s předchozími údaji, které prokázaly, že perorální podávání sloučenin vanadu u zvířat s STZ indukovaným nebo geneticky dědičným či nutričním diabetem významně zlepšilo hyperglykémii . U lidí Soveid a kol. referovali o bezpečnosti a účinnosti perorální léčby vanadylsulfátem během 30 měsíců u pacientů s diabetem 1. typu snížením potřeby inzulinu a hladiny glukózy v krvi.
Naše studie také odhalila, že hypoglykemický účinek VOSO4 byl doprovázen výrazným zvýšením hladiny bazální inzulinémie u diabetické skupiny v závislosti na dávce. Při dávce 10 mg se hladina inzulinémie u diabetických potkanů téměř normalizovala. Pokles hladiny glukózy v krvi zaznamenaný zejména u diabetických potkanů vystavených působení sloučeniny vanadu může skutečně souviset se současným zvýšením plazmatických koncentrací inzulinu. Tyto výsledky byly v souladu s předchozími údaji týkajícími se účinnosti sloučenin vanadu při zlepšování diabetického stavu .
Dále jsme zkoumali vliv podávání vanadu na citlivost na inzulin u diabetických a nediabetických potkanů. U ND skupin jsme prokázali maximální hypoglykemizující účinek inzulínu 60-90 min po zavedení hormonu. U D skupin však léčba VOSO4 v dávce 10 mg zvýšila citlivost na inzulin s rychlejším a výraznějším poklesem glykemie po zavedení hormonu, zatímco dávka 5 mg reakci glykemie D potkanů významně nezměnila. Zlepšení citlivosti na inzulín vyvolané přípravkem VOSO4 je v souladu s četnými studiemi, které naznačují, že vanad lze považovat za silné inzulínové mimetikum nebo inzulínovou trofiku v různých tkáních .
Ukázalo se, že sloučeniny vanadu se vyznačují více způsoby účinku, které vedou ke snížení hladiny cukru v krvi . Studie in vivo a in vitro uvádějí, že vanadylsulfát zvyšuje transport glukózy a metabolismus v kosterních svalech, játrech a tukových tkáních . Díky své strukturní podobnosti s ortofosforečnanovými anionty inhibují organické deriváty vanadu proteinovou fosfotyrosinfosfatázu . Inhibují také aktivitu PTP-1B, enzymu zodpovědného za defosforylaci inzulinového receptoru, což způsobuje inzulinovou rezistenci . Dalším mechanismem snižování hladiny glukózy v krvi sloučeninami vanadu je aktivace kinázy PKB/Akt vedoucí ke zvýšení vychytávání glukózy transportérem GLUT4 . Aktivace PKB/Akt stimuluje také fosforylaci GSK3, což vede ke stimulaci syntézy glykogenu . Na druhé straně bylo zjištěno, že inhibice C-jun N-terminální kinázy zlepšuje citlivost na inzulín u experimentálního diabetu .
Vanad zvyšuje transport a oxidaci glukózy a aktivitu inzulín-receptorové tyrosinkinázy a působí inzulínu podobné účinky na metabolismus glukózy a lipidů biochemickými cestami závislými nebo nezávislými na inzulínu .
Je známo, že léčba STZ ničí beta buňky pankreatických ostrůvků, což vyvolává diabetes mellitus závislý na inzulínu . V této studii jsme tedy prokázali zmenšení plochy pankreatických ostrůvků spojené s výrazným snížením počtu imunoreaktivních beta buněk pro inzulin u diabetické skupiny ve srovnání s nediabetickými kontrolními zvířaty. V obou skupinách ND a D však léčba VOSO4 zvětšila velikost pankreatických ostrůvků ve srovnání s příslušnými kontrolními skupinami. A co je nejdůležitější, léčba diabetických potkanů VOSO4 zvýšila v závislosti na dávce počet inzulín imunopozitivních beta buněk na rozdíl od diabetické neléčené skupiny, což naznačuje, že VOSO4 může vytvářet beta buňky u diabetických potkanů indukovaných STZ. Ve skutečnosti se počet beta buněk v ostrůvcích diabetických potkanů léčených 5 a 10 mg VOSO4 významně nelišil od skupiny ND. To je v souladu s předchozími výzkumy týkajícími se pankreatické inzulinotropní vlastnosti této sloučeniny . Zajímavé je, že léčba vanadem také významně zvýšila počet beta buněk v ostrůvcích nediabetických potkanů.
V myším modelu pankreatu s aloxanovou perfuzí Waguri et al. popsali procesy regenerace beta buněk z extra-isletových prekurzorových buněk. U STZ-diabetických potkanů by léčba VOSO4 skutečně mohla stimulovat proliferaci beta buněk z intraisletových endokrinních buněk a diferenciaci z extraisletových prekurzorových buněk.
Závěrem tato studie ukazuje, že vanadylsulfát by mohl být užitečný jako potenciální antidiabetikum. Jelikož jsou však současné důkazy stále omezené a založené převážně na zvířecích modelech a je málo známo o terapeutických formulacích a vedlejších účincích sloučenin vanadu, je zapotřebí dalšího zkoumání jejich dlouhodobého používání jako konvenční terapie u pacientů s diabetem.
Konflikt zájmů
Autoři prohlašují, že v souvislosti s publikací tohoto článku nedošlo ke střetu zájmů.
Poděkování
Tato práce byla podpořena tuniským Ministerstvem pro vysoké školství a vědecký výzkum.