Představte si, že byste chtěli založit květinovou zahradu. Můžete se poohlédnout po květinách, které se dokonale hodí do vašeho prostředí, i když mohou být drahé a vyžadovat odbornou péči. Nebo si můžete vybrat druhy, které možná nejsou ideální, ale které rostou všude, jsou cenově dostupné a nepotřebují velkou péči. Podobně když zahajujete výzkumný projekt a musíte se rozhodnout, zda použijete lidské primární buňky nebo nesmrtelné buněčné linie, musíte zvážit řadu faktorů.
Chcete vytvořit model buněčné kultury, který by věrně reprezentoval situaci u člověka in vivo? V takovém případě jsou lepší volbou lidské primární buňky. Pokud také plánujete publikovat své výsledky, měli byste mít na paměti, že recenzenti mohou chtít, abyste své výsledky ověřili v systému, který odpovídá lidské fyziologii. Nebo chcete model, se kterým se snadno pracuje a který je dobře zavedený? Zde by byly vhodnější nesmrtelné buněčné linie, i když se buňky nemusí chovat přesně tak, jak se chovají u člověka.
Lidské primární buňky: nahlédnutí do skutečného života
Lidské primární buňky jsou izolovány přímo z tkání a zachovávají si morfologické a funkční vlastnosti své původní tkáně. Například původní nádorová tkáň z kolorektálního karcinomu si zachovává několik nádorových markerů a známých mikroRNA. Oproti tomu buněčné linie vykazují rozdíly v jejich expresi (Pastor et al., 2010).
Primární buňky však nežijí věčně. Podléhají procesům senescence a mají omezený potenciál sebeobnovy a diferenciace. Jak stárnou, vykazují morfologické a funkční změny, a proto byste je měli používat v časných pasážích. Důležité jsou také genetické vlastnosti a věk dárců, protože jejich buňky se mohou za stejných kultivačních podmínek chovat odlišně. To může být výhodné, když zkoumáte, jak se specifické buněčné vlastnosti liší napříč populací, nebo při testování nových sloučenin. Na druhou stranu, vyžadují vaše testy nízkou variabilitu? Pak použijte buňky od stejného dárce. Jednou z výhod lidských primárních buněk je, že se nemusíte spoléhat na zvířecí modely. To znamená, že se můžete vyhnout mezidruhovým rozdílům – například v anatomii, molekulárních drahách a metabolismu – které mohou ovlivnit toxicitu a způsob účinku léčiv.
O úspěchu rozhoduje to, jak s primárními buňkami zacházíte
Lidské primární buněčné kultury lze iniciovat ze zdravých buněk nebo z nádorových buněk. Pocházejí od zdravých dárců, dárců orgánů, chirurgických vzorků, fetálních tkání nebo posmrtných dárců. Při plánování experimentů mějte na paměti, že zdroje lidských primárních buněk jsou omezené. To znamená, že se vám nemusí podařit získat další materiál od stejného dárce. Také primární kultury získané z tkáňových explantátů jsou směsí různých buněk v různých stadiích, takže pokud chcete iniciovat homogennější kultury, možná budete muset purifikovat specifické typy buněk. Protože jsou primární buňky citlivější než buněčné linie, často vyžadují další živiny a růstové faktory.
Protože různé typy buněk potřebují k růstu a přežití různá média, vždy optimalizujte kultivační podmínky pro jednotlivé typy buněk. Buněčné linie potřebují vysoké množství séra. Sérum však není standardizované a různé šarže mohou vykazovat vysokou variabilitu mnoha obsažených látek. To může výrazně ovlivnit výsledky vašeho výzkumu a dokonce je učinit nekonzistentními. V případě lidských primárních buněk pamatujte, že vysoké hladiny antibiotik snižují jejich životaschopnost a růst. Jakmile buňky dosáhnou různých stadií kultivace, je třeba je charakterizovat a identifikovat případné morfologické a funkční změny. To je důležité pro kontrolu kvality. Správná praxe v oblasti buněčných kultur samozřejmě vyžaduje, abyste dokumentovali všechny informace potřebné ke sledování materiálů a metod. Tím zajistíte, že váš model bude transparentní a reprodukovatelný (Pamies et al., 2018).
Boj proti kontaminaci endotoxiny v buněčných kulturách
Kontaminace ohrožuje studie buněčných kultur. Viníky nejsou jen bakterie, plísně, kvasinky a mykoplazmy, problémy způsobují také endotoxiny. Ovlivňují růst a funkci buněk in vitro i in vivo (Ryan et al, 2018). Endotoxiny jsou lipopolysacharidy pocházející z vnější membrány většiny gramnegativních bakterií, které jsou stabilní i při vysokých teplotách. Endotoxiny často kontaminují laboratorní nádobí, protože vykazují vysokou afinitu k hydrofobním materiálům, jako je plast. Zdrojem kontaminace je voda používaná k mytí, média a séra, aditiva, laboratorní plasty a sklo. Endotoxiny můžete detekovat pomocí testu limulus amebocytárního lyzátu (LAL), protože LAL v jejich přítomnosti vytváří kvantifikovatelné gelové sraženiny.
Různé typy buněk reagují na přítomnost endotoxinů odlišně a limity endotoxinů by měly být stanoveny pro každý typ buněk v kulturách in vitro (Nomura et al., 2017). Chcete-li minimalizovat riziko kontaminace endotoxiny, používejte certifikovaná nepyrogenní média, séra a laboratorní nádobí a kontrolujte vodu používanou v laboratoři, zejména při práci s citlivými buňkami.
Buněčné linie: nedílná součást biologického výzkumu
Práce s primárními buňkami se opírá o desetiletí výzkumu s použitím buněčných linií. Od počátku 20. století poskytují buněčné linie vědcům skvělé poznatky o biologických procesech lidských buněk. Nesmrtelné buněčné linie se staly mocným nástrojem pro nespočet aplikací, včetně testování metabolismu a cytotoxicity léčiv, studia funkce genů a také výroby vakcín, protilátek a biologických sloučenin.
Jak již bylo zmíněno, cíl vašeho výzkumu určuje typ buněčné kultury, kterou použijete. Výzkumníci, kteří plánují zkoumat základní biologické procesy, manipulovat s buněčnými funkcemi, zavádět nové metody nebo provádět předběžné screeningy, si obvykle vybírají imortalizované buněčné linie. Proč? Jsou cenově výhodné, snadno se s nimi pracuje a lze je udržovat v kultuře po delší dobu. Buněčné linie se také snadno manipulují a rozšiřují. (Kaur et al., 2012). Je na pořadu dne vysoce výkonný screening? Zde by mohla být výhodou i neomezená zásoba materiálu.
I když lze experimentální výsledky získané pomocí buněčných linií jasně interpretovat a důsledně porovnávat s předchozími studiemi, mějte na paměti, že fyziologická relevance těchto studií nemusí být příliš vysoká. Existují také limity toho, co lze s buněčnými liniemi dělat. Některé z nich totiž vykazují pouze okrajovou podobnost s původními primárními buňkami, protože sériové pasáže mohou způsobit odchylky v genotypu a fenotypu. Můžete skončit se změněným genomickým obsahem a abnormálním expresním profilem. Buněčné linie postrádají klíčové morfologické nebo funkční vlastnosti, takže nemusí být schopny indukovat relevantní biomarkery. To znamená, že výsledky, které jste získali s buněčnými liniemi v laboratoři, nelze plně převést na člověka. Během delší doby mohou být nesmrtelné buněčné linie také kontaminovány jinými buňkami nebo mikroorganismy (viz příspěvek na blogu: Mycoplasma Contamination – Small Organisms Cause Big Trouble). Proto prosím dbejte této rady:
Před jakoukoli prací s buněčnými liniemi je vždy nejprve ověřte, abyste se ujistili, že vaše buňky nejsou chybně identifikovány nebo kontaminovány (Lorsch et al, 2014).
Zkrátka, při výběru lidských primárních buněk nebo nesmrtelných buněčných linií vycházejte z cíle svého výzkumu. V mnoha případech nabízejí nesmrtelné buněčné linie velmi cenný model pro předběžné experimenty. K replikaci klíčových zjištění pak použijte lidské primární buňky. Tím se zvýší překlad a vaše výsledky budou relevantnější pro lidskou fyziologii.