Abstrakt

Tato studie zkoumá mechanismus, který je základem zlepšujícího účinku zinku na plodnost u obézních potkanů, pomocí proteomiky. Byly studovány účinky tří různých dávek ZnSO4 na spermatogenezi a hladiny hormonů. Testikulární spermatogeneze byla sledována pomocí barvení HE. Hladiny estrogenů a testosteronu v séru byly měřeny chemiluminiscenční mikročásticovou imunoanalýzou. Proteomická analýza spermií byla provedena pomocí kapalinové chromatografie s hmotnostní spektrometrií. Databáze DAVID byla použita k provedení analýzy obohacení GO a analýzy drah KEGG diferenciálně exprimovaných genů a online databáze STRING byla použita ke konstrukci sítě PPI. U skupiny potkanů léčených ZnSO4 se zvýšil počet spermií, pohyblivost spermií a hormony testosteronu. ZnSO4 zlepšil strukturu varlat a abnormality spermatogeneze způsobené obezitou. Proteomická analýza ukázala, že v celkem 6 vzorcích spermií ze skupiny léčené ZnSO4 a ze skupin s obezitou bylo 401 rozdílně exprimovaných proteinů. Diferenciální proteiny byly vloženy do webové stránky DAVID. Identifikovaných 341 proteinů bylo následně klasifikováno podle jejich biologických funkcí. Analýza KEGG ukázala, že mezi obohacené signální dráhy patří glykolýza/glukoneogeneze, metabolismus uhlíku, citrátový cyklus, metabolismus mastných kyselin a metabolismus pyruvátu. Ukázalo se, že některé proteiny jsou spojeny s dráhami degradace valinu, leucinu a isoleucinu. Analýzou STRING bylo získáno 36 uzlových proteinů. Analýza Cytoscape ukázala, že tyto proteiny se účastní především devíti sítí zahrnujících metabolické procesy, oxidačně-redukční procesy, aerobní dýchání, sestřih RNA a konjugaci glutathionu. ZnSO4 může zlepšit plodnost obézních samců potkanů regulací exprese proteinů souvisejících s metabolismem, zánětem a zráním spermií.

1. Úvod

Obezita je spojena s neplodností samců. Mezi nárůstem míry mužské neplodnosti, poklesem kvality spermatu a nárůstem míry obezity existuje určitá časová shoda . Obezita vede k patologickým změnám ultrastruktury varlat a výrazně se zvyšuje apoptóza spermatogenních buněk . Snížení počtu zralých spermií může být jedním z důvodů vedoucích k nízké spermatogenní schopnosti obézních lidí.

U obézních lidí se vyskytují poruchy metabolismu stopových prvků. Narušená úroveň metabolismu stopových prvků v těle vyvolá odpovídající účinky na metabolismus lipidů. V mužském reprodukčním systému jsou ionty zinku distribuovány především ve varleti, nadvarleti, prostatě a spermatu. Zinek je markerem funkce prostaty. Kromě toho reguluje funkci spermií, působí jako kofaktor většiny enzymatických reakcí a pomáhá udržovat pohyblivost spermií. Zinek také hraje důležitou roli při vývoji varlat a tvorbě spermií . Nedostatek zinku výrazně zvyšuje apoptózu zárodečných buněk v myším varleti a způsobuje zástavu spermatogeneze a poškození oplodnění . Studie prokázaly, že obézní muži mají 3,5krát vyšší pravděpodobnost oligozoospermie než muži s normální hmotností . Suplementace zinkem může snížit hmotnost obézních lidí . Stav glukózy v krvi (glykémie nalačno), parametry krevních lipidů (celkový cholesterol, hladina triglyceridů, cholesterol v lipoproteinech o vysoké hustotě a cholesterol v lipoproteinech o nízké hustotě) a krevní tlak se po suplementaci zinkem zlepšují . Perorální zinkový přípravek může zlepšit obsah zinku v semenné plazmě, podpořit přeměnu jaderného proteinu spermií (tj. z lyzinu na arginin) a inhibovat předčasnou depolymerizaci jádra spermií. Může zlepšit pohyblivost spermií a kvalitu spermatu neplodných pacientů bez zjevných vedlejších účinků . Použití proteomiky k pochopení účinků léčby ZnSO4 na proteiny spermií při obezitě je však stále omezené a je třeba dalšího zkoumání.

V této studii byly zkoumány účinky tří různých dávek ZnSO4 na spermatogenezi a hormonální hladiny obézních potkanů. Mechanismus, který je základem tohoto účinku, byl dále analyzován pomocí proteomické analýzy.

2. Materiály a metody

2.1. Analýza a vyhodnocování výsledků studie Zvířata

Sedmitýdenní potkani Sprague Dawley (o hmotnosti 180-200 g) byli zakoupeni z Centra pro experimentální zvířata Lékařské univerzity v Hebei. Byli chováni v cyklu 12 hodin tma/světlo v místnosti s řízeným vzduchem (teplota, ; vlhkost, ) s volným přístupem k vodě a krmivu pro zvířata. Všechny postupy pokusů na zvířatech byly schváleny etickou komisí Hebei Institute of Family Planning Science and Technology.

2.2. Pokusy na zvířatech byly prováděny v souladu se zákonem o chovu zvířat. Vytvoření modelu obezity, rozdělení zvířat do skupin a odběr vzorků

Potkani byli náhodně rozděleni do dvou skupin: skupina s normálním krmivem (15 zvířat na skupinu) a skupina s modelem obezity (30 zvířat na skupinu). Každá skupina byla po dobu 8 týdnů krmena odpovídajícími dietami, tj. normální krmnou dávkou pro normální skupinu a dietou s vysokým obsahem tuku pro modelovou skupinu obezity. Tělesná hmotnost potkanů byla vážena každý týden a zaznamenávána po dobu 8 týdnů. Model obezity byl považován za úspěšný, když průměrná tělesná hmotnost modelové skupiny byla 1,2krát vyšší než u kontrolní skupiny. Byla změřena délka potkanů (od špičky nosu po řitní otvor) a Leeho index byl vypočten podle vzorce .

Po vytvoření modelu obezity byli modeloví potkani náhodně rozděleni do dvou skupin: skupina s obezitou a skupina léčená ZnSO4. Potkani ve skupině léčené ZnSO4 dostávali ZnSO4 (Tianjin Yongda Chemical Reagent Company Limited) (3,2 mg/kg/d) po dobu 4 týdnů perorálně. Na konci pokusu byla u každé skupiny změřena tělesná hmotnost, hmotnost varlat, nadvarlat a peritestikulárního tuku a odebrána krev z břišní aorty. Vzorky spermií byly odebrány z kaudálního nadvarlete. Varlata byla odstraněna.

2.3. Počet spermií a jejich pohyblivost

Levý nadvarle každého potkana byl odebrán ihned po usmrcení a byl přenesen do zkumavky obsahující 1 ml teplého (37 °C) fyziologického roztoku. Poté byly protřepávány při teplotě 37 °C po dobu 5 minut, aby došlo k rozptýlení spermií. Přibližně 10 μl naředěné suspenze spermií bylo přeneseno do každé počítací komory hemocytometru pro stanovení koncentrace a pohyblivosti spermií. Pohyblivost byla měřena jako procento pohyblivých spermií (třída a+b) z celkového počtu spermií.

2.4. Pohyblivost byla měřena jako procento pohyblivých spermií (třída a+b) z celkového počtu spermií. Stanovení glukózy v séru nalačno, krevních lipidů a inzulínu

Hladiny celkových cholesterolů, triglyceridů, lipoproteinů o nízké hustotě a lipoproteinů o vysoké hustotě v séru byly měřeny na analyzátoru Siemens Centaur XP pomocí chemiluminiscenční mikročásticové imunoanalytické soupravy (Medical System Biotechnology Co., LTD). Glukóza v séru nalačno byla měřena pomocí soupravy pro detekci glukózy (Medical System Biotechnology Co., Ltd., Ningbo, Čína) na analyzátoru ACCUTE TBA-40FR (Toshiba Medical Systems Co., Tokio, Japonsko). Hladiny inzulinu v séru byly stanoveny chemiluminiscenční imunoanalýzou na systému UniCel DxI 800 (Beckman Coulter, CA, USA) s odpovídajícími činidly (Beckman Coulter, CA, USA).

2.5. Enzymově vázaná imunosorbční analýza (ELISA)

Hladina leptinu byla stanovena pomocí souprav ELISA (Multisciences Biotech Co., Ltd., Hangzhou, Čína). Po ukončení reakce byla odečtena absorbance při vlnové délce 450 nm.

2,6. Barvení HE

Sestřičky byly přes noc fixovány v Bouinově roztoku. Poté byla varlata dehydratována pomocí alkoholu a zalita do parafínu. Vzorky byly rozřezány na řezy o tloušťce 5 μm a obarveny barvením HE. Spermatogeneze ve varlatech byla pozorována pod světelným mikroskopem.

2.7. Měření androgenních hormonů

Hladiny estrogenů a testosteronu v séru byly měřeny na analyzátoru Siemens Centaur XP pomocí chemiluminiscenční mikročásticové imunoanalýzy. Detekční souprava byla zakoupena od společností Siemens Healthcare Diagnostic Inc. a Cayman Chemical, Michigan, USA.

2.8. Stanovení hladiny testosteronu v krvi. Kapalinová chromatografie – hmotnostní spektrometrie

Vzorky proteinů spermií použité v této studii pocházely ze tří skupin (normální skupina, modelová skupina obezity a skupina ošetřená ZnSO4). Vzorky spermií byly odebrány z kaudálního nadvarlete. Krátce, proteiny byly extrahovány lyzátovým pufrem s 8 M močovinou, 10 mM DTT a inhibitorem proteázy. Sonikace byla prováděna po dobu 3-5 minut. Supernatant byl odebrán po centrifugaci 20000 g po dobu 10 min při 4 °C a protein byl kvantifikován Bradfordovou metodou. Extrahované proteiny byly inkubovány se 100 mM TEAB na 100 μl a poté s 200 mM TCEP při 55 °C po dobu 1 h. Poté bylo přidáno 5 μl 375 mM jodoacetamidu (IAA). Po 30minutové inkubaci ve tmě byl přidán předchlazený aceton a inkubováno přes noc při -20 °C. Supernatant byl po odstředění 8000 g při 10 °C po dobu 10 min opatrně odstraněn a lyzát byl ponechán 2-3 min při pokojové teplotě, aby vyschl. Nakonec bylo smícháno 100 μg proteinu, 100 μl 100 mM roztoku TEAB a protein s poměrem enzymu trypsinu (1 : 50) a enzymové štěpení bylo provedeno přes noc při 37 °C.

Kapalinová chromatografie-hmotnostní spektrometrie: byly odebrány částečně natrávené vzorky a rozpuštěny v roztoku A (2% ACN/98% H2O/0,1% FA). Po odstředění při 20000 g po dobu 30 minut byl odebrán supernatant a proteinová sekvence byla detekována pomocí hmotnostního spektrometru EASY-nLC liquid phase-Q Exactive (americká firma Thermo Fisher).

Podmínky hmotnostní spektrometrie byly 90 min pro dobu sběru dat, 2 kV pro sprejové napětí, 320 °C pro teplotu kapiláry, 27 % pro normalizovanou srážkovou energii a 300-1400 Da pro rozsah sběrné hmotnosti. Primární parametry byly 70000 pro rozlišení, 36 pro cíl AGC, 60 ms pro maximální IT a profil pro typ dat spektra. Sekundární parametry byly 17500 pro rozlišení, 54 pro cíl AGC, 80 ms pro maximální IT a 3,0 m/z pro izolační okno.

2,9 . Vyhledávání dat

V prohledávači MaxQuant 1.5.2.8 je první chyba 20 ppm, druhá chyba 0,02 Da. Pevná úprava je následující. Cystein je modifikován na Carbamidomethyl-Cys a variabilní modifikace je následující: Oxidation-M, LysisC nebo Trypsin, nebo Glu-C digesce. Enzymatická digesce umožňuje až 2 chybějící místa. Vyplňování mezer v datech, normalizace a screening rozdílů () byly provedeny pomocí standardních nastavení softwaru Perseus. Celkem bylo identifikováno a kvantifikováno 1344 proteinů v 6 vzorcích z obou skupin. Byly získány kvalitativní a kvantitativní informace o Zn a G skupině na rozdílových proteinech. Software Perseus provedl -test a analýzu významnosti kvantitativních výsledků a poměrů proteinů. Získaný seznam diferenciálních proteinů je následující: na základě výsledků -testu a výsledků analýzy diferenciálního rozdělení bylo získáno celkem 401 významných diferenciálních proteinů

2.10. Analýza GO (genová ontologie) a KEGG (Kjótská encyklopedie genů a genomů)

Diferenciální protein byl importován do webové stránky DAVID (Functional Annotation Bioinformatics Microarray Analysis) (https://david.ncifcrf.gov/) pro základní bioinformatickou extrakci. Webové nástroje poskytované službou DAVID byly použity k vyhledání funkčních anotačních termínů a drah, které byly obohaceny o výše identifikované proteiny, včetně buněčné složky, molekulární funkce a biologického procesu.

2.11. V případě, že byly proteiny obohaceny o funkční anotaci, byly použity webové nástroje DAVID. Analýza sítě interakcí proteinů

Vyšetřené diferenciální proteiny byly importovány do online databáze STRING (https://string-db.org/) za účelem analýzy. Byla nakreslena mapa diferenciální sítě genových interakcí. Interaktivní síťová data byla exportována do softwaru Cytoscape 3.2 pro určení centrálního uzlu sítě proteinů.

2.12. Statistická analýza

Data byla zobrazena jako . Statistická analýza byla provedena v programu SPSS22.0 pomocí jednosměrné analýzy rozptylu (ANOVA), přičemž za statisticky významnou byla považována hodnota < 0,05.

3. Výsledky

3.1. Změny parametrů spermatu a hladiny testosteronu ve spermatu po léčbě ZnSO4

V porovnání s kontrolní skupinou se významně zvýšila tělesná hmotnost, peritestikulární tuk, Leeův index, celkové cholesteroly, triglyceridy, lipoprotein o vysoké hustotě a leptin u potkanů obézní skupiny a leptin u potkanů skupiny léčené ZnSO4. Ve srovnání s kontrolní skupinou se u potkanů obézní skupiny významně snížil lipoprotein o nízké hustotě. Ve srovnání s obézní skupinou se u skupiny potkanů léčených ZnSO4 snížila tělesná hmotnost, peritestikulární tuk a Leeův index a rozdíl byl statisticky významný (tabulka 1). Za účelem zjištění vlivu ZnSO4 na plodnost potkanů byly u každé skupiny nejprve vyhodnoceny parametry spermatu podle kritérií WHO 2010 . Počet spermií a pohyblivost spermií byly u obézní skupiny inhibovány, jak ukazuje tabulka 2. Ve srovnání s obézní skupinou se počet spermií a pohyblivost spermií potkanů léčených ZnSO4 zvýšily, což naznačuje, že ZnSO4 zlepšuje parametry spermatu u obézních potkanů. Obezita sama o sobě může způsobit zvýšení hladiny krevních lipidů, ale naše výsledky ukázaly, že hladina glukózy, krevních lipidů a inzulínu v krvi nedosáhla úrovně diabetu. Lze se domnívat, že matoucí faktory diabetických komplikací byly vyloučeny. Dále jsme zjišťovali hladinu testosteronu v séru. Výsledky ukázaly, že hormony testosteronu se zvýšily ve skupině léčené ZnSO4 ve srovnání se skupinou obézních (tabulka 2). Léčba ZnSO4 tedy mohla zlepšit kvalitu spermatu obézních potkanů.

3.2. Tabulka 2

Hladiny hormonu testosteronu u normální skupiny, skupiny s obezitou a skupiny léčené ZnSO4. Léčba ZnSO4 zlepšuje zotavení poškození varlat vyvolaného obezitou

Následně jsme provedli histologickou analýzu testikulární tkáně a výsledky jsou uvedeny na obrázku 1. Na obrázku 2 jsou znázorněny výsledky histologické analýzy. Podle histologického vyšetření varlat vykazovala normální skupina normální spermatogenezi (obrázky 1(a) a 1(d)), zatímco skupina s obezitou vykazovala narušenou spermatogenezi, protože lumen semenných kanálků bylo téměř prázdné (obrázky 1(b) a 1(e)). Jak jsme očekávali, skupina léčená ZnSO4 vykazovala ve srovnání s obézní skupinou významné zlepšení histologie varlete s výskytem normálních Sertoliho a Leydigových buněk a nenarušenou spermatogenezí (obrázky 1(c) a 1(f)). ZnSO4 tedy může zlepšit strukturu varlat a abnormality spermatogeneze způsobené obezitou.

Obrázek 1

Příčný řez morfologií varlat pro každou skupinu při zvětšení (a-c) 40x a (d-f) 100x barvením HE: (a, d) normální skupina, (b, e) skupina s obezitou a (c, f) skupina ošetřená ZnSO4.

3.3. Klasifikace 341 proteinů spermií pomocí bioinformatiky: Pro určení diferenciálně exprimovaných proteinů byla provedena proteomická analýza: buněčná složka, molekulární funkce a biologický proces

. Celkem bylo identifikováno a kvantifikováno 1344 proteinů v celkem 6 vzorcích spermií ze skupiny léčené ZnSO4 a skupiny s obezitou. Software Perseus provedl -test a analýzu rozdílové významnosti kvantitativních výsledků a poměrů proteinů. Celkem bylo získáno 401 významných proteinů. Diferenciální proteiny byly vloženy do webové stránky DAVID pro rozdíly ve funkci proteinů skupiny léčené ZnSO4 a skupiny s obezitou. V klasifikaci GO bylo analyzováno 371 proteinů a 30 proteinů neodpovídalo. Identifikovaných 341 proteinů pak bylo klasifikováno podle jejich biologických funkcí. K vyhledávání funkčních anotačních termínů a drah, které byly obohaceny o výše identifikované proteiny, jsme použili webové nástroje poskytované DAVIDem. Výsledky těchto analýz byly uvedeny na obrázku 2. Při analýze obohacení funkčními anotačními termíny jsme se zaměřili na ontologii buněčné komponenty, molekulární funkce a biologického procesu s a .

(a)

(b)

(c)

(d)

.
(a)
(b)
(c)
(d)

Obrázek 2

Funkční klasifikace a obohacení identifikovaných proteinů ve spermiích. Analýza funkční klasifikace GO celkem identifikovaných proteinů ve spermiích podle jejich (a) buněčné složky, (b) molekulární funkce a (c) biologického procesu. (d) Analýza obohacení drah KEGG celkového počtu identifikovaných proteinů ve spermiích.

Ve skupině „buněčná složka“ (obrázek 2(a)) analýza kategorií ukázala, že 59 % proteinů s významnými rozdíly byly složky organel a 60,7 % z nich byly složky organel. Kromě toho 29,6 % proteinů patřilo do makromolekulárního komplexu. Analýza GO termínů „molekulární funkce“ ukázala, že 22 % proteinů bylo klasifikováno jako proteiny s katalytickou aktivitou (obr. 2b). Ostatní proteiny bylo možné klasifikovat jako proteiny vázající proteiny, rRNA a enzymy. Z hlediska databáze „biologických procesů“ (obrázek 2(c)) byla většina z 24 % proteinů spojena s metabolickým procesem. Kromě toho byly proteiny spojeny s transportem, přenosem signálu, buněčnou smrtí, buněčnou adhezí, procesem imunitního systému a reprodukcí. Výsledky analýzy signálních drah (obrázek 2(d)) s koncentrovanými proteiny a obohacením jsou následující. Byly narušeny a ovlivněny četné metabolické dráhy, jako je glykolýza/glukoneogeneze, metabolismus uhlíku, citrátový cyklus (TCA cyklus), metabolismus mastných kyselin a metabolismus pyruvátu, a u některých proteinů byla prokázána souvislost s dráhami degradace valinu, leucinu a izoleucinu.

3.4. Dráhy degradace proteinů, které jsou spojeny s dráhami degradace valinu, leucinu a izoleucinu Účinky zinku jsou dále identifikovány podle rozdílně exprimovaných proteinů spermií

Kvantitativní analýza byla provedena za účelem porovnání hladin proteinů mezi třemi skupinami. V diferenciálních proteinech jsme vybrali metabolické proteiny, proteiny spojené s transportem zinku a uzlové proteiny v síti (tabulka 3). Proteiny se statisticky významnými změnami byly uvedeny na obrázku 3. Jednalo se o tyto proteiny: ARG2, COX5B, ZNT1, LYAR a TM165. Ve srovnání se skupinou obézních byla exprese ARG2, COX5B a ZNT1 ve skupině léčené ZnSO4 významně snížena, zatímco exprese LYAR a TM165 byla významně zvýšena.

Cluster Score () Nodes Edges Node 1 5.2 11 26 IDH3B, PMPCB, IDH3A, ATP5O, ATP5H, COX5B, ACADM, ACLY, LIPE, CPT1B, CPT1A IDS 2 5 5 10 HNRNPF, PRPF19, HNRNPU, HNRNPM, SRSF2 3 4 4 5 GSTM2, GSTM4, GSTM1, MGST 4 4 4 6 QSOX1, APLP2, NUCB1, LAMBB2 5 3.333 4 5 ADAM2, EQTN, ACR, PRM2 6 3 3 3 3 ANXA5, HPRT1, GGT1 7 3 3 3 ARF5, ASAP1, ARF2 8 3 3 3 3 SEC13, PAFAH1B1, XP01

Tabulka 3

Uzly sítě proteinových interakcí STRING.

Obrázek 3

Kvantifikační analýza ukázala šest významně exprimovaných proteinů. Mezi tyto proteiny patří ARG2, COX5B, ZNT1, LYAR a TM165. # ve srovnání s normální kontrolou; ve srovnání s obezitou.

3,5. Diferenciální síť interakcí proteinů je vytvořena pomocí databáze sítí STRING

STRING je online analytický software, který analyzuje a předpovídá interakce mezi známými proteiny. Software STRING zavádí skórovací mechanismus, který vytváří odpovídající váhy na různých zdrojích dat a nakonec poskytuje komplexní skóre a poté konstruuje mapu sítě interakcí protein-protein . Pro analýzu bylo do online databáze STRING (http://string-db.org/) importováno 341 diferenčních proteinů, bylo identifikováno 341 proteinů a vytvořena mapa sítě diferenčních genových interakcí. Poté byla interaktivní síťová data exportována do softwaru Cytoscape 3.2 k určení centrálního uzlu sítě proteinů. Je vidět, že síť diferenciálního složení proteinů je složitá (obr. 4). Poté jsme použili zásuvný modul programu Cytoscape k analýze uzlových proteinů v síti a z analýzy bylo získáno celkem 36 uzlových proteinů (tabulka 3). Ze seznamu nejlepších sítí vytvořených pomocí STRING jsme vybrali dílčí sítě. Analýza Cytoscape ukázala, že tyto proteiny se účastní především devíti sítí, včetně metabolického procesu, oxidačně-redukčního procesu, aerobní respirace, sestřihu RNA a konjugace glutathionu.

Obrázek 4

Síť interakcí proteinů STRING. Kruh znázorňuje gen a čára znázorňuje vztah mezi geny.

4. Diskuse

Světová zdravotnická organizace definuje člověka s abnormálním nebo nadměrným hromaděním tuku jako nadváhu nebo obezitu a tento stav představuje rostoucí hrozbu pro zdraví lidí na celém světě . Některé zprávy ukazují, že míra obezity se rychle zvyšuje , což nejen zvyšuje riziko onemocnění, ale souběžně s tím se u pacientů zvyšuje i riziko vzniku poruch reprodukce. Vzhledem k tomu, že se celosvětově zhoršuje reprodukční funkce mužů , stále více lidí si uvědomuje, že obezita snižuje kvalitu spermatu. Se zvýšeným BMI se mění parametry spermatu, čímž se mění fyzikální a molekulární struktura spermií . Předchozí studie zjistily, že koncentrace spermií a celkový počet pohyblivých spermií byly škodlivě ovlivněny vysokým BMI . V této studii potkani ve skupinách s obezitou vykazovali významné snížení koncentrace spermií a pohyblivosti spermií ve srovnání se skupinami s normální hmotností, zatímco ZnSO4 parametry spermatu ve srovnání se skupinou s obezitou zlepšil.

Rovnováha pohlavních hormonů může ovlivňovat mužskou reprodukci a stav nadváhy může ovlivňovat hladiny hormonů u mužů . Současně studie ukázaly, že obezita úzce souvisí s endokrinními poruchami, jako jsou abnormality pohlavních hormonů . Obezita u mužů má negativní dopad na mužský reprodukční potenciál kvůli změnám hladin hormonů . Proto jsme testovali sérové hladiny u jednotlivých skupin . Hormony testosteronu se zvýšily ve skupině léčené ZnSO4 ve srovnání s normální skupinou a skupinou s obezitou. Zdá se, že léčba ZnSO4 významně zvýšila hladiny androgenních hormonů tak, aby odpovídaly úrovni normální kontrolní skupiny. Snížení tělesné hmotnosti a hladiny krevních lipidů u potkanů léčených ZnSO4 může vést k opravě Leydigových buněk, a tím ke zvýšení hladiny testosteronu. V důsledku toho může být regenerován funkční samčí reprodukční systém, což napomáhá spermatogenezi a regeneraci struktury varlat . Je zřejmé, že histologie varlat skupiny léčené ZnSO4 se zlepšila, přičemž došlo k regeneraci Sertoliho a Leydigových buněk a obnovení spermií v lumen. Rozsáhlá srovnávací proteomika proto poskytuje účinný přístup k identifikaci případných rozdílů v expresi proteinů mezi obézními skupinami a skupinami léčenými ZnSO4. Naše studie identifikovala rozdíly v profilech exprese proteinů mezi normálními plodnými spermiemi a spermiemi ze skupin léčených ZnSO4.

GO anotační analýza ukázala, že 24 % proteinů bylo spojeno s metabolickými procesy a 22 % proteinů bylo klasifikováno jako proteiny s katalytickou aktivitou. Ostatní proteiny byly klasifikovány jako proteiny vázající se na proteiny, rRNA a enzymy, včetně vazby na ATP. Je dobře známo, že proteiny vázající ATP hrají zásadní roli v biologických procesech, což naznačuje změny v syntetických a metabolických procesech. Mitochondrie jsou organely, které poskytují buňkám energii (ATP). Mitochondrie jsou také primárním cílem oxidačního stresu. V mužském těle jsou mitochondrie hlavní energetickou továrnou v procesu zrání spermatogenních buněk a také poskytují energii spermiím po ejakulaci. Pokud tedy u obézních mužů dojde k oxidačnímu stresu, mohou být mitochondrie ve spermiích značně poškozeny. Spermie jsou náchylné k oxidačnímu stresu a postrádají schopnost opravit poškození. Strava s vysokým obsahem tuků vyvolává u obézních potkanů oxidační stres, který způsobuje poškození mitochondriální membrány spermií a ovlivňuje funkci mitochondrií . Egwurugwu a kol. dospěli k závěru, že síran zinečnatý má ve fyziologických dávkách některé významné pozitivní účinky na androgeny a kvalitu spermií. Při vyšších dávkách však byl škodlivý.

ARG2 je známý tím, že se lokalizuje v mitochondriích . Hraje také klíčovou roli v produkci ornitinu, který je prekurzorem prolinu, hydroxyprolinu a polyaminu a je nezbytný pro buněčnou proliferaci. Obezita a s ní spojená onemocnění se vyznačují nízkou úrovní chronického zánětu . ARG2 podporuje prozánětlivé reakce v makrofázích a přispívá k průkazu aterosklerózy a inzulínové rezistence související s obezitou . Domníváme se, že časná obezita může vést k upregulaci arginázy, což vede k systémovým změnám arginázy a metabolitů argininu. Upregulace ARG2 ve skupině obézních může souviset s buněčnou proliferací a chronickým zánětem způsobeným obezitou. Argináza zlepšuje obezitou vyvolané abnormality jaterních lipidů a systémového tuku tím, že inhibuje aktivaci drah zapojených do metabolismu jaterních triglyceridů a mitochondriální funkce .

Z těchto proteinů je vysoce zajímavý zejména COX5B, který souvisí s mitochondriální funkcí a produkcí buněčné energie . Cytochromoxidáza (COX, komplex IV) je enzym mitochondriálního elektronového transportního řetězce, který se nachází v mitochondriální vnitřní membráně a jehož aktivita je nutná k vytvoření protonové hnací síly, která pohání následnou syntézu ATP . Jedná se o jednu ze tří mitochondriálních izoforem cytochromoxidázy, tedy komplexu IV mitochondriálního dýchacího řetězce. COX5B se podílí na posledním kroku oxidativní fosforylace s produkcí H2O a na udržování elektrochemického gradientu potřebného k produkci ATP. Snížené hladiny ARG2 a COX5B u potkanů léčených síranem zinečnatým tak mohou naznačovat vliv zinku na plodnost obézních potkanů, zejména na regeneraci varlat, spermatogenezi a pohyblivost spermií.

Některé diferenciálně exprimované proteiny identifikované v této studii se podílejí na procesu transportu zinku. Elgazar et al. například zjistili, že ZnT1 je přítomen v plazmatické membráně a cytoplazmě podpůrných buněk. Studie ukázaly, že Znt1 hraje důležitou roli v homeostáze zinku u dospělých myší . Transkripční faktor 1 reagující na kovy (MTF-1) hraje roli v koordinaci buněčných reakcí na homeostázu kovů a oxidační stres. MTF-1 je transkripční faktor závislý na zinku, který se zvyšující se koncentrací zinku stimuluje geny metalothioneinu a zinkového transportéru-1 (ZNT-1) . Foster et al. ukázali, že relativní exprese mRNA zinkových transportérů je velmi variabilní. ZnT1 je nejhojněji zastoupen ve varleti a spolupůsobí při transportu zinku přes plazmatickou membránu. Noh et al. uvedli, že hladiny ZnT1 mRNA jsou mírně zvýšené u obézních žen a změny transportéru zinku mohou být také spojeny se zánětlivými stavy souvisejícími s obezitou.

Ly1 antibody reactive homolog (LYAR) byl poprvé popsán Su et al. jako cDNA kódující protein zinkového prstu izolovaný z myší T-buněčné leukemické linie . Gen Lyar, o němž je známo, že je hojně exprimován ve varlatech, kóduje nukleární protein, který obsahuje motiv zinkového prstu typu LYAR C2HC a tři jaderné lokalizační signály. Lee a kol. zjistili, že protein LYAR je přítomen ve spermatocytech a spermatidách, nikoli však ve spermiích. My jsme však zjistili expresi LYAR ve spermiích a jeho exprese se snížila ve spermiích obézních potkanů a zvýšila ve skupinách léčených ZnSO4. Bylo zjištěno, že LYAR je spojen s cytoplazmatickými ribozomy v mužských zárodečných a nádorových buňkách a podílí se na zpracování preribozomální RNA v jádře . LYAR je modulátorem jednoho ze dvou základních kroků iniciace translace v samčích zárodečných buňkách savců a některých typech nádorů . LYAR významně potlačuje transkripci genů oxidativního stresu, včetně genů SLC7A11, HMOX1 a CHAC1. Onkoprotein Myc zvyšuje expresi LYAR aktivací transkripce jeho genu a zvýšení regulace LYAR zase chrání nádorové buňky před apoptózou zprostředkovanou oxidačním stresem prostřednictvím snížení exprese genu CHAC1 .

Transmembránový protein 165 (TM165) je Golgiho transmembránový protein , jehož nedostatek způsobuje vrozenou poruchu glykosylace. TM165 je transkripčně i translačně nadměrně exprimován u hepatocelulárního karcinomu a souvisí s invazivní schopností hepatocelulárního karcinomu . Údaje získané v nedávné studii však poskytují několik indicií o jejich zapojení do homeostázy vápníku a manganu . TM165 dodává Ca2+ a Mn2+ do Golgiho komplexu výměnou za H+ k udržení funkce laktosyntázy a potenciálně i dalších glykosyltransferáz . Lidský Golgiho protein TM165 může transportovat vápník a mangan v kvasinkových a bakteriálních buňkách . Naše studie zjistila, že exprese TM165 u obézních potkanů se snížila a zvýšila po suplementaci zinkem, což naznačuje, že TM165 se zvýšil po suplementaci zinkem.

5 . Závěry

Závěrem lze říci, že výsledky této studie poskytují důkaz, že ZnSO4 může zlepšit hladinu hormonů, regeneraci varlat a plodnost. Proteomická analýza dále ukazuje, že ZnSO4 může zlepšit plodnost obézních samců potkanů regulací exprese proteinů souvisejících s metabolismem, zánětem, zráním spermií a dalšími interakcemi.

Dostupnost údajů

Údaje použité na podporu závěrů této studie jsou k dispozici na vyžádání.

Zveřejnění informací

Financující agentura se nijak nepodílela na návrhu studie, sběru a analýze údajů, rozhodnutí publikovat nebo přípravě rukopisu.

Střet zájmů

Autoři prohlašují, že v souvislosti s publikací tohoto článku nedošlo ke střetu zájmů.

Poděkování

Tato studie byla podpořena projektem klinické medicíny financovaným vládou provincie Hebei pro vzdělávání vynikajících talentů a základní výzkum (grant č. 20170183).

Poděkování

Tato studie byla podpořena projektem klinické medicíny financovaným vládou provincie Hebei pro vzdělávání vynikajících talentů a základní výzkum (grant č. 20170183).