Abstrakt

Minimální inhibiční koncentrace (MIC) a minimální fungicidní koncentrace (MFC) byly stanoveny pro 38 olejů rostlinného původu proti Candida albicans. V této studii byly použity čtyři kmeny včetně jednoho standardního kmene. Jako pozitivní kontroly byly použity antimykotika flukonazol a amfotericin B. Bylo zjištěno, že standardní kmen (ATCC10231) použitý v této studii je vysoce rezistentní vůči flukonazolu: K částečné inhibici růstu tohoto kmene bylo zapotřebí 3000 μg ml-1 flukonazolu a úplné inhibice nebylo možné dosáhnout. Ostatní kmeny Candida byly citlivé na 5 μg ml-1 flukonazolu. Všechny použité kmeny byly citlivé na amfotericin B. Z 38 testovaných olejů bylo 23 shledáno účinnými a 15 neúčinnými. Na základě jejich MFC byly účinné oleje rozděleny do tří kategorií. Sedm olejů, které působily fungicidně při méně než 0,15% koncentraci olejů, bylo zařazeno do nejúčinnější třídy. Oleje vykazující MFC v rozmezí koncentrací 0,16-1,5 % byly považovány za středně účinné. Devět olejů, které vyžadovaly koncentraci vyšší než 1,5 %, bylo považováno za méně účinné. Kmen rezistentní vůči flukonazolu (MTCC 227) byl citlivý nejméně na 23 rostlinných silic. Výsledky této studie naznačují, že silice rostlinného původu mohou najít využití jako potenciální látky proti kandidám.

1 Úvod

Amfotericn B a flukonazol jsou dvě důležité látky používané v antimykotické chemoterapii proti lidským patogenním houbám . Amfotericin B se používá jako lék volby u nevyléčitelně nemocných pacientů . Azolové léčivo, flukonazol, je široce předepisováno proti různým infekcím způsobeným bakterií Candida albicans . Přestože jsou tyto léky velmi uznávané pro svou účinnost, je známo, že mají vedlejší účinky . Flukonazol má fungistatickou povahu a existují zprávy o vzniku rezistence na flukonazol mezi klinickými izoláty C. albicans . Proto je třeba hledat lepší, nová antimykotika proti infekcím způsobeným C. albicans, která jsou účinná a mají méně vedlejších účinků.

Mnoho přírodních látek, jako jsou rostlinné produkty včetně extraktů, olejů atd. se tradičně používá proti různým onemocněním . Některé rostlinné produkty jsou účinné proti plísňovým a bakteriálním infekcím . Esenciální oleje jako Tea tree oil, Lemon grass oil, Citronella oil, Palmarosha oil a některé jejich složky byly testovány proti růstu C. albicans in vitro.

Testovali jsme účinnost 38 rostlinných olejů in vitro proti čtyřem izolátům C. albicans. Jsou uvedeny minimální inhibiční koncentrace (MIC) a minimální fungicidní koncentrace (MFC) účinných olejů. Na základě účinnosti (MFC) jsou oleje rozděleny do tří kategorií.

2 Materiály a metody

2.1 Chemikálie a kmeny

V této studii byl použit standardní kmen, typový kmen ATCC10231 (MTCC 227/CA IV), referenční kmen navržený pro stanovení amfotericinu B, a tři klinické izoláty C. albicans. Tři klinické izoláty C. albicans, a to SRTCC I (CA I), SRTCC II (CA II), SRTCC III (CA III), byly získány ze SRTCC Culture Collection Center, School of Life Sciences, SRTM University, Nanded (MS). Indie. Standardní kmen byl zakoupen z The Institute of Microbial Technology (IMTECH), Chandigarh, Indie.

V této studii bylo použito 38 rostlinných olejů. Některé oleje laskavě poskytl Ústřední ústav léčivých a aromatických rostlin (CIMAP), Lucknow, Indie, a zbývající oleje a antimykotika, amfotericin B a flukonazol, byly zakoupeny na místním trhu.

2.2 Příprava inokula

Všechny kmeny C. albicans použité v této studii byly kultivovány při teplotě 30 °C po dobu 24 hodin v třepacím inkubátoru s použitím média Yeast Extract Peptone a Sabouraud Dextrose. Buňky byly sklizeny centrifugací, suspendovány ve sterilní destilované vodě a ihned použity. Počet buněk byl stanoven pomocí hemocytometru a upraven na 5 × 106 KTJ ml-1.

2.3 Screening rostlinných silic na anti-kandidovou aktivitu diskovým difuzním testem

Antikandidová aktivita 38 rostlinných silic byla testována standardním diskovým difuzním testem . Byly připraveny destičky Sabouraud Dextrose Agar a osazeny 5 × 106 KTJ ml-1 pomocí inokula kmenů Candida připraveného výše uvedeným způsobem. Asepticky bylo 5 μl rostlinných olejů naneseno na 5mm disky z filtračního papíru (Whatman č. 1). Tyto disky byly poté přeneseny do středu osetých destiček. Pro každou koncentraci byly použity tři destičky a inkubovány při 30 ± 2 °C. Průměr inhibiční zóny byl měřen po 48hodinové inkubaci.

2.4 Stanovení minimální inhibiční koncentrace (MIC) rostlinných silic agarovou ředicí metodou

Minimální inhibiční koncentrace (MIC) rostlinných silic byly stanoveny agarovou ředicí metodou (23) Agarové destičky byly připraveny přidáním YPD agaru obsahujícího různé koncentrace rostlinných silic (tj. 0,03-3 % v/v). Pro zvýšení rozpustnosti oleje byl přidán Tween 20 0,5 % (v/v). Tyto destičky byly inokulovány 103 KTJ s použitím inokula kmenů Candida připraveného výše uvedeným způsobem. Destičky byly uchovávány ve třech opakováních pro každou koncentraci. Jako kontrola byly použity destičky s Tween 20, ale bez rostlinného oleje. Všechny tyto destičky byly inkubovány při teplotě 30 ± 2 °C. Destičky byly pozorovány a počty kolonií byly spočítány po 48 hodinách inkubace. Hodnoty MIC byly stanoveny jako nejnižší koncentrace oleje zabraňující viditelnému růstu kmenů Candida .

2.5 Stanovení minimální fungicidní koncentrace (MFC) rostlinných olejů pomocí Brothovy makroředicí metody

Minimální fungicidní koncentrace (MFC) rostlinných olejů byla stanovena pomocí Brothova makroředicího testu (NCCLS M27-A, referenční metoda doporučená pro testování antifungální citlivosti kvasinek) . Rozsah koncentrací (0,03-3 % v/v) rostlinného oleje byl připraven v bujónovém médiu YPD v baňkách. Tween 80 byl přidán v konečné koncentraci 0,001 % (v/v) pro zvýšení rozpustnosti oleje. Do každé baňky bylo naočkováno 5 × 105 KTJ ml-1 kmenů Candida. Jako kontrola byly použity baňky obsahující Tween 20, ale bez rostlinného oleje. Baňky byly inkubovány při 30 ± 2 °C v orbitálním třepacím inkubátoru (100 ot./min.) po dobu 48 h. Z každé baňky bylo 5 μl kultury naočkováno na YPD destičky a inkubováno při 30 ± 2 °C po dobu 48 h. Destičky byly pozorovány a MFC byly stanoveny jako nejnižší koncentrace rostlinného oleje zcela inhibující růst kmenů Candida.

3 Výsledky

3.1 Screening rostlinných olejů na anti-kandidovou aktivitu

Testované izoláty C. albicans vykazovaly různou citlivost k olejům. Většina silic však byla shledána účinnou a vykazovala značnou aktivitu již při velmi nízkých koncentracích. Dvacet pět z 38 testovaných olejů způsobilo inhibiční zónu (ZOI) o velikosti 1-30 mm. Sedmnáct olejů způsobilo ZOI 10-20 mm. Šest olejů vykazovalo ZOI 1-9 mm proti všem čtyřem testovaným kmenům. Jasmínový a levandulový olej nedokázaly inhibovat růst kmenů Candida s výjimkou CA IV. (tabulka 1). (13 olejů neinhibovalo růst kmenů C. albicans v dávkách 5 μl.)

3.2 Stanovení MIC rostlinných silic proti C. albicans

MIC 23 účinných silic a dvou běžně předepisovaných léčiv, flukonazolu a amfotericinu B, byly stanoveny proti čtyřem izolátům C. albicans. Oleje vykazovaly inhibici růstu v závislosti na koncentraci. V několika případech vykazovaly testované kmeny různou citlivost, ale v MIC nebyl výrazný rozdíl (tabulka 2).

Všechny čtyři izoláty byly shledány citlivými na amfotericin B. Koncentrace 2,5 μg ml-1 amfotericinu B byla dostatečná k úplné inhibici růstu kmene CAI a kmene CA IV (ATCC10231). Kmeny CA II a CA III vyžadovaly k úplné inhibici růstu 3 μg ml-1 amfotericinu B (tabulka 2).

Odpověď na flukonazol byla zjištěna rozdílná. Kmen Ca III byl nejcitlivější a k úplné inhibici růstu mu stačila pouze koncentrace 2 μg ml-1 flukonazolu. Kmeny CA I a CA II vyžadovaly k úplné inhibici růstu 5 μg ml-1 flukonazolu () (tabulka 2). Kmen CA IV byl k flukonazolu vysoce rezistentní: Pro částečnou inhibici růstu bylo zapotřebí 3000 μg ml-1 , tj. 1500násobek MIC kmene CA III. Úplné inhibice růstu nebylo u tohoto kmene dosaženo ani při velmi vysoké koncentraci.

K úplné inhibici růstu všech čtyř izolátů stačila 0,01% koncentrace skořicového oleje. Jasmínový a levandulový olej způsobily pouze mírnou inhibici růstu a nepodařilo se je zcela inhibovat. Sedm olejů zcela inhibovalo růst kmenů C. albicans v koncentračním rozmezí 0,03-0,15 %. U 11 olejů se MIC pohybovala od 0,16 % do 1,0 % Pět olejů vyžadovalo koncentraci vyšší než 1,0 % (tabulky 2 a 3).

3.3 Stanovení MFC rostlinných olejů proti C. albicans

Minimální fungicidní koncentrace (MFC) je definována jako nejnižší koncentrace oleje, která vede k úhynu 99,9 % inokula. Všechny oleje inhibující růst vykazovaly fungicidní aktivitu s výjimkou jasmínového a levandulového oleje. Obecně bylo zjištěno, že fungicidní koncentrace byla vyšší než MIC, s výjimkou několika případů, jako jsou oleje z máty peprné, geránia, ocimumu, hřebíčku a zázvorové trávy, které způsobily smrt 99,9 % inokula při MIC. Podle jejich MFC proti ATCC10231 lze účinné oleje rozdělit do tří tříd. Oleje, které způsobily fungicidní účinek při koncentraci 0,03-0,15 %, jsou považovány za nejúčinnější (ME). Oleje vyžadující 0,15-1,0% koncentraci jsou zařazeny do skupiny středně účinných (MoE). Ty, u nichž byl zjištěn fungicidní účinek při koncentraci vyšší než 1,0 %, jsou považovány za méně účinné (LE).

Nejúčinněji působilo sedm olejů (ME) (tabulky 2 a 3). Nejlepší byl skořicový olej, který měl fungicidní účinek při 0,03% koncentraci u všech čtyř izolátů C. albicans. Hřebíčkový olej působil fungicidně při 0,12% koncentraci a nebyl zjištěn žádný rozdíl mezi MIC a MFC. U většiny ME olejů byl pro fungicidní účinek vyžadován 2-4násobek MIC. Reakce izolátů Candida na některé členy této skupiny byla rozdílná, tj. kmene CA II v případě oleje z japonské máty a zázvorové trávy, CA III v případě oleje z citronové trávy a CA IV v případě oleje ze zázvorové trávy (tab. 2).

Mátový a čajovníkový olej byly nejlepší ze skupiny sedmi členů ME a způsobovaly fungicidní účinek při 0,25% koncentraci (tab. 3). Olej Tulsi působil fungicidně při 0,5% koncentraci, 1% byl MFC oleje Camphor, Lemon, Ocimum a Ylang-ylang. U několika členů této skupiny byl rovněž zjištěn rozdíl v citlivosti. U těchto olejů byl vyžadován dvojnásobek MIC s výjimkou oleje z máty peprné a oleje z ocimumu (tabulka 2).

U devíti olejů byla zjištěna nižší účinnost (tabulka 3). Tyto oleje vyžadovaly k fungicidnímu účinku více než 1,0 %. MFC těchto olejů se pohyboval od 1,0 % do 3 % s výjimkou jasmínového, zázvorového a jalovcového oleje, které nebyly fungicidní až do 3% koncentrace. CA II a CA III vykazovaly rozdílnou citlivost (tabulky 2 a 3).

4 Diskuse

Protikandidová aktivita některých esenciálních olejů, jako je Tea tree oil, je dobře známá . Mnoho přípravků používaných proti vaginální kandidóze způsobené C. albicans obsahuje Tea tree oil jako aktivní složku . Několik olejů rostlinného původu bylo navrženo v alternativní medicíně proti mikrobiálním infekcím včetně kandidózy a zánětu dásní . Azolová antimykotika a jejich deriváty však nadále dominují jako léky volby proti kandidovým infekcím, a to ve formě lokálních aplikací nebo jako perorální léky . S výjimkou Tea tree oleje, který se v Austrálii používá již více než 80 let, se na trh nedostalo mnoho rostlinných přípravků . Některé přípravky obsahující rozmarýnový olej se používají proti plísním způsobujícím lupy . In vitro byla zaznamenána anti-kandidová aktivita esenciálních olejů, jako jsou Tea tree, Lemongrass, Citronella, Peppermint a Palmarosa . Zkoumali jsme účinnost 38 olejů rostlinného původu na anti-kandidovou aktivitu in vitro proti čtyřem izolátům C. albicans (tabulky 1 a 2). Nejméně 23 z testovaných olejů se ukázalo jako slibné účinné látky. Tyto oleje bylo možné rozdělit podle jejich účinnosti (tabulka 3). Jeden z izolátů, u kterého byla zjištěna rezistence k flukonazolu, byl inhibován při velmi nízké koncentraci všech účinných olejů rostlinného původu testovaných v této studii (tabulka 2).

Diskový difuzní test je standardní metoda široce používaná pro rychlý screening přírodních produktů na antifungální aktivitu . Pomocí této velmi vhodné testovací metody jsme provedli screening rostlinných olejů. Z této studie vyplývá, že je třeba opatrnosti, protože různé oleje mohou mít různou rychlost difuze na agarových plotnách, což může přispívat k rozdílům v inhibičních zónách a vést k chybným závěrům ohledně jejich antifungální aktivity. Například některé oleje, které vykazovaly menší inhibiční zóny ve srovnání s jinými, byly velmi účinné proti kmenům Candida v testu ředění bujónu NCCLS, který nezahrnuje difúzi. Například skořicový olej vykazoval v diskové difuzní zkoušce ZOI 24 mm, zatímco olej z citronové trávy 30 mm. Ale v testu MFC byl skořicový olej (0,01 %) shledán lepším než olej z citronové trávy (0,06 %). Fungicidní aktivita je u antimykotik považována za žádoucí vlastnost, protože by mohla houbu z tkání zcela eliminovat. Amfotericin B je fungicidní, je známo, že je velmi účinný proti lidským patogenním houbám a používá se jako lék volby při systémových houbových infekcích, a to i přes své závažné vedlejší účinky . Flukonazol, široce předepisovaný antimykotikum proti infekcím vyvolaným kvasinkami rodu Candida, má fungistatickou povahu a může vyžadovat dlouhodobé používání .

Je povzbudivé, že většina olejů použitých v této studii byla fungicidní již při nízkých koncentracích. O způsobu účinku přírodních produktů inhibujících růst Candida není k dispozici mnoho informací. Do budoucích studií je třeba zahrnout více kmenů rezistentních vůči flukonazolu/azolu. Rostlinné silice by mohly najít využití jako anti-kandidové látky proti azol-rezistentním kmenům. Většina olejů použitých v této studii má dlouhou historii použití v potravinách, cukrovinkách a jako složky parfémů . Pokud však mají být zvažovány v topických přípravcích, je třeba pečlivě prozkoumat jejich pravděpodobné dráždivé a jiné nežádoucí účinky u lidí.

Poděkování

Autoři děkují Dr. S.A. Suryawanshi, Hon’ble Vice Chancellor, SRTM University, Nanded (MS) India, za povzbuzení.