Nekompetitivní inhibitor je inhibitor, který se váže pouze na komplex enzym-substrát. Jeho vazebné místo se vytvoří až po interakci enzymu a substrátu mezi sebou. Nekompetitivní inhibice nefunguje, pokud se snaží zapojit další substráty. Komplex enzym-substrát-inhibitor nevytváří žádný produkt
E + S -> ES
ES + I -> ESI -X-.> E + P
Nekompetitivní inhibitor se váže na komplex enzym-substrát a brání enzymu reagovat se substrátem za vzniku produktu, jako takový dobře funguje při vyšších koncentracích substrátu a enzymu, které jsou navázány na substráty enzymů; vazba vede ke snížení koncentrace vazby substrátu na enzym, Km a Vmax a ke zvýšení vazebné afinity enzymu k substrátu.
E + I -> (přes S) ES + I -> E + P
kde E je enzym, I je inhibitor, ES je komplex enzym-substrát a P je produkt.
Vazba substrátu modifikuje strukturu enzymu a zpřístupňuje místo pro vazbu inhibitoru. Nekompetitivní inhibice snižuje maximální rychlost i KM. K,M je koncentrace substrátu, kdy je rychlost poloviční oproti maximální rychlosti na základě Michaelis-Mentenova kinetického modelu. Vmax i KM se snižují stejnou měrou. Vmax se přesto sníží, i když se zvýší vazba enzymu na substrát, protože se tvoří komplexy ESI. ESI komplexy inhibují tvorbu produktu. Nekompetitivní inhibitor sníží KM a vytvoří lepší vazbu enzym-substrát, protože se váže pouze na ESI komplex. Komplex ES se však neustále vyčerpává, protože se inhibitor váže a vytváří komplexy ESI. Proto se v zájmu udržení rovnováhy mezi komplexy ES a ESI a podle Le Chatelierova principu reakce posouvá směrem k větší tvorbě ES, kdy se na enzymy naváže více substrátu a vytvoří se více ES. To v konečném důsledku vede ke snížení KM. Snížená KM svědčí o lepší vazbě enzymu na substrát, protože enzym může dosáhnout poloviční maximální rychlosti při nižší koncentraci substrátu. Vazba enzym-substrát je v jistém smyslu velmi účinná, protože enzym a substrát mají vysokou afinitu a silně spolu interagují.
.