Testování minimální inhibiční koncentrace (MIC) a minimální baktericidní koncentrace (MBC) definuje účinnost testovaného materiálu z hlediska koncentrace, při které inhibuje růst (minimální inhibiční koncentrace, (MIC) nebo zcela usmrtí (minimální baktericidní koncentrace, MBC) 1 x 106 (jeden milion) mikroorganismů během 18 až 20hodinové inkubace (35 ± 2 °C).
Metoda MIC měří účinek klesajících koncentrací antiseptika po definovanou dobu z hlediska inhibice růstu mikrobiální populace. Koncentrace léčiva potřebná k vyvolání účinku je definována jako minimální inhibiční koncentrace a je obvykle několik set až tisíckrát nižší než koncentrace zjištěná v hotové lékové formě.
Metody pro ředicí testy citlivosti na antimikrobiální látky pro bakterie, které rostou aerobně
Standardní referencí používanou jako základ pro provedení stanovení minimální inhibiční koncentrace (MIC) je nejaktuálnější verze Metod pro ředicí testy citlivosti na antimikrobiální látky pro bakterie, které rostou aerobně (v současnosti CLSI Doc. M7-A9, Clinical Laboratory Standards Institute ) nebo anaerobně (CLSI Doc. M11-A8).
MIC & Přehled testu MBC
Přípravek se sériově ředí v poměru 1:2 v růstovém médiu vhodném pro podporu růstu každého výzvového mikroorganismu, obvykle Mueller-Hinton Broth (MHB) nebo Mueller-Hinton Agar (MHA), aby vznikla řada ředění přípravku v médiu až do poměru 1:32 768 (podle BSLI SOP L-2045). V závislosti na typu produktu však nemusí být ředicí řada provedena tak daleko. Do zkumavek v sérii, z nichž každá obsahuje 2,0 ml alikvotu produktu sériově naředěného v růstovém médiu, se nyní přidá 1,0 ml suspenze 1 x 106 CFU/ml výzvového druhu. Po 18 až 24 hodinách inkubace se zkumavky obsahující suspenzi výzvového mikroorganismu/produktu/média vyšetří, aby se určilo nejvyšší ředění produktu (a naopak nejnižší koncentrace produktu), které zcela inhibuje růst mikroorganismu, jak se určí pouhým okem. Tato hodnota ředění (a/nebo hodnota koncentrace produktu) se zaznamená jako hodnota minimální inhibiční koncentrace.
Pokud je požadováno stanovení MBC, přenesou se změřená množství ze suspenze ředění, která představuje minimální inhibiční koncentraci, a ze dvou nebo tří suspenzí ředění předcházejících ředění minimální inhibiční koncentrace na destičky s pevným růstovým médiem, které se pak inkubují 24 hodin při 37E±2E. Po inkubaci se destičky vyšetří na růst napadeného mikroorganismu. To ředění přípravku (a/nebo koncentrace přípravku), které nezpůsobí žádný růst, se zaznamená jako MBC. Všimněte si, že postupy testování MIC/MBC lze provádět pomocí sériových ředění produktu v poměru 1:2 v živném agarovém médiu (testování v pevné fázi) nebo pomocí sériových ředění produktu v poměru 1:2 v živném bujónovém médiu (testování v suspenzní fázi). Pokud sponzor výslovně nepožaduje metodu ředění v agaru, provede společnost BSLI testování MIC pomocí metody ředění v bujónu v makrozkumavce, protože je mnohem méně náročná na materiál a čas.
Produkty testované v rámci zkoušeného nového léčiva
U produktů, které musí být testovány v rámci IND, FDA na straně 31444 TFM jasně specifikuje, jaké mikroorganismy musí být použity k testování produktů in vitro. Pro studii minimální inhibiční koncentrace TFM uvádí, že hotový přípravek, účinná látka přípravku a vehikulum přípravku musí být podrobeny zkoušce s 25 ATCC kmeny a 25 čerstvými klinicky izolovanými kmeny každého z 12 gramnegativních a 11 grampozitivních druhů bakterií a dvou skupin druhů kvasinek (Candida albicans a Candida spp., nikoli albicans). To tedy zahrnuje velmi rozsáhlou studii, která zahrnuje testování 1 250 kmenů celkem 25 bakterií a kvasinek, které jsou uvedeny v TFM, oproti každé ze tří konfigurací výrobku.
V posledních letech FDA od tohoto zatěžujícího požadavku poněkud ustoupila – ačkoli hotový přípravek musí být testován oproti 1 250 kmenům, jak bylo uvedeno, aktivní látka přípravku a nosič přípravku musí být testovány pouze s pěti ATCC kmeny a pěti čerstvými klinicky izolovanými kmeny každého z 25 druhů bakterií/kvasinek. I tak je to celkem 250 kmenů, které musí být testovány jak pro účinnou látku, tak pro vehikulum, a celková studie TFM MIC je poměrně rozsáhlá a nákladná – celkem 1 750 jednotlivých stanovení minimální inhibiční koncentrace. Úřad FDA rovněž povoluje některé druhové záměny (např. jiné druhy Bacteroides než B. fragilis a jiné druhy koaguláza-negativních stafylokoků než S. epidermidis, S. hominis, S. haemolyticus a S. saprophyticus), aby se přizpůsobil nedostatku ATCC kmenů a/nebo klinických izolátů některých druhů vyžadovaných TFM. A vzhledem k tomu, že alkoholy obecně nejsou antimikrobiálně aktivní přibližně po dvou ředěních v poměru 1:2, FDA nevyžaduje údaje o MIC u přípravků, v nichž je alkohol jedinou aktivní složkou.
MIC & MBC Proof of Concept in Marketing Purposes
Ačkoli společnost BSLI provedla několik plnohodnotných studií minimální inhibiční koncentrace, které vyžaduje TFM pro přípravky registrované v rámci IND, většina studií minimální inhibiční koncentrace a příležitostných studií MBC se provádí pro účely prokázání koncepce a pro marketingové účely. V těchto typech studií společnost BSLI obvykle doporučuje klientům, aby byly testovány kmeny ATCC všech 25 druhů/kmenů uvedených v TFM a klinický izolát každého z nich (tj. celkem 50 testovaných kmenů)
.