3.53.4.3 Syntetisk fage-terapi

Bakteriofager, eller blot kaldet fager, har spillet en central rolle i udviklingen af molekylærbiologi, bakteriegenetik og har leveret de tidligste værktøjer til rekombination af DNA-molekyler, såsom restriktionsenzymer og ligaser. I det sidste årti har studiet af fagenes resistensmekanismer ført til opdagelsen af en af de vigtigste teknologier for SB siden PCR, nemlig CRISPR-nukleasesystemerne, som bakterier og arkæaer har udviklet som et adaptivt forsvar mod eksogent DNA. Den nylige identifikation af talrige andre tidligere ukarakteriserede antiphagesystemer kan give yderligere banebrydende teknologier til SB-applikationer.45 I denne historiske kontekst er det derfor passende, at SB nu anvendes på phage for at perfektionere deres anvendelse som terapeutiske midler.

Phage blev opdaget uafhængigt af hinanden af Frederik Twort og Félix D’Hérelle i begyndelsen af det 20. århundrede46,47 og blev kort efter forfulgt som antimikrobielle midler til behandling af infektionssygdomme som kolera og pest. I Østeuropa blev phageterapi almindeligt udbredt, og der findes den dag i dag flere anerkendte behandlingscentre, f.eks. i Georgien og Polen. I Vesten blev phageterapi efter nogle sporadiske succeser i begyndelsen ikke længere anvendt, efterhånden som antibiotika blev almindeligt tilgængelige. I dag er der med stigningen af antimikrobielt resistente patogener, oprindeligt de såkaldte ESKAPE-stammer48 , men nu et endnu bredere sæt patogener49 , som forventes at medføre flere dødsfald end kræft inden 2050, fornyet interesse for fagterapi.

Anvendelsen af fager har flere fordele i forhold til antibiotika, primært potentialet til at målrette mod specifikke stammer og dermed lade det gavnlige mikrobielle samfund forblive intakt, og også muligheden for at overvinde resistens ved hjælp af supplerende fagecocktails, “træning” af fager på udvalgte værtsstammer eller blot isolering af nye fager mod et patogen. Omvendt er der adskillige forhindringer, der skal overvindes, og områder, der skal forbedres, hvis fagetoterapi skal blive et pålideligt lægemiddel og udbredt i Vesten, f.eks. stærke kliniske forsøg med ordentlige kontroller, reduktion af tiden til at identificere fager med det relevante værtsområde, overvindelse af fageresistens og udelukkelsesmekanismer hos målstammen uden behov for komplekse cocktails, omgåelse af uønskede immunreaktioner på fagepartiklerne og inddæmning af generaliseret overførsel af antibiotikaresistensgener eller bakterielle virulensfaktorer. Selv i tilfælde af en vellykket aflivning af en målstamme kan den hurtige lysis af et stort antal bakterier og den samtidige frigivelse af endotoksiner og superantigener resultere i et stærkt infammatorisk respons og et ugunstigt klinisk resultat.

Den meget modulære organisering af fagenes genomer og sammensætningen af fagenes struktur som funktionelle moduler, såsom halefibre, pigge, halerør og capsid, gør fagenes ideelle mål for SB-tilgange, idet fagenes genomer på en måde allerede er organiseret i BioBricks. I en tidlig skabelon for fremtidigt design af syntetiske fager blev den filamentøse fage Pf3 modificeret til at behandle Pseudomonas aeruginosa-infektion i en musemodel50 . Et eksportproteingen i Pf3 blev erstattet med et gen, der koder for BglII-restriktionsendonukleasen, med den begrundelse, at (1) denne genudskiftning gør Pf3 ikke-replikativ og dermed indfører en indeslutningsstrategi, (2) fagen kan opformeres stabilt i en vært, der indeholder BglII-metylase-genet, og (3) BglII vil katalysere dobbeltstrengsbrud i genomisk DNA i målstammen til dræbning. Et vigtigt resultat af denne undersøgelse var, at behandling af inficerede mus med den manipulerede fage Pf3R eller med en lytisk fage gav sammenlignelige overlevelsesmuligheder for mus, der blev udfordret med en minimalt dødelig dosis på 3, men ved en minimalt dødelig dosis på 5 var overlevelsesraten betydeligt bedre med Pf3R-fagbehandling. Analyse af serumcytokinniveauer viste et reduceret inflamatorisk respons, hvilket indikerer, at det bedre resultat for Pf3R-behandlingsgruppen skyldes den effektive aflivning af målstammen uden lysis og endotoxinfrigivelse.

Dræbningen af P. aeruginosa med Pf3R er afhængig af fagenes værtsområde for at sikre målretningsspecificitet, da BglII-restriktionssteder forventes at være til stede i stort set alle bakterielle genomer. En forbedring foreslås af den bemærkelsesværdige opdagelse af en bakteriofag, som har fået et CRISPR/Cas-system fra en ukendt kilde til eget brug.51 Det fage-kodede CRISPR/Cas-system er i stand til at erhverve nye spacere, og CAS3-nukleasen er blevet rettet mod et kromosomalt element, som dens vært, Vibrio cholera, bruger til medfødt immunitet. Efter denne opdagelse blev type II CRISPR-systemet fra Streptococcus pyogenes konstrueret i M13-bakteriofagen med spacere til at målrette sekvenser for antibiotikaresistens og virulensgener i Escherichia coli, idet forfatterne omtaler disse enheder som RNA-guidede nukleaser (RGN’er).52 For at demonstrere dette systems udsøgte specificitet var en RGN i stand til at dræbe en stamme med en enkelt nukleotidpolymorfi i DNA-gyrase, som giver quinolonresistens, på en diskriminerende måde. Endvidere var de i et kunstigt konsortium af tre bakteriestammer i stand til at dræbe udvalgte stammer (400-20 000 gange mere dræbende end kontrolstammer), mens de andre medlemmer af konsortiet blev efterladt intakte. Specificiteten af CRISPR/Cas-medieret aflivning kunne udvide fagetoterapi ud over målretning af patogener til præcis modulering af menneskelige mikrobiomer, hvis sammensætning er blevet impliceret i prognosen for visse kræftformer og endda neurologiske lidelser som autisme, Parkinsons og Alzheimers via tarm-hjerne-aksen.

En ideel syntetisk fageplatform kunne være en platform, hvor værtsområdet er konstrueret til at være meget bredt, mens CRISPR/Cas-nyttelasten sørger for specificitet i målretningen af stammer. På denne måde kan fager let anvendes til behandlinger, uden at der skal isoleres en ny platform ad hoc for hvert patogen. Endvidere kunne det brede værtsområde kombineret med CRISPR-arrays, der er rettet mod flere antibiotikaresistens- eller virulensgener, gøre det muligt at anvende phageterapi på forhånd, dvs. før patogenidentifikation. Værtsområdeudvidelsesstrategier omfatter fremadrettede genetiske screeninger for at identificere fagerreceptorer og nødvendige værtsfaktorer53 , udvinding af sekvenser af receptorbindingsprotein (RBP) fra bakterielle genomer og genstart af syntetiske fager, som f.eks. kan kode for receptorbindingsprotein RBP-biblioteker til HTS54,55 . Maskering af receptorer ved kapsler kan overvindes ved at udtrykke exopolysaccharidhydrolyserende enzymer56 og andre enzymer til nedbrydning af biofilm57 , mens andre maskeringsmekanismer og fasevariation i receptorekspression kan overvindes ved hjælp af fager, der er konstrueret med flere halefibre indeholdende forskellige RBP’er eller RBP’er til ikke-kanoniske højt konserverede mål på celleoverfladen. Bakterier anvender adskillige anti-fage-systemer, hvoraf de vigtigste er den medfødte immunitet i form af restriktionsmodificering og den adaptive immunitet i form af CRISPR/CAS, men omvendt har fager også modudviklet adskillige strategier til at besejre disse systemer, f.eks. ved at anvende ikke-kanoniske nukleotider i deres DNA, have færre restriktionssteder eller hypermethylering af deres genomer og levere proteiner, der hæmmer restriktionsenzymer eller forbedrer værtens methyleringsenzymer.

Den syntetiske fageplatform, der er beskrevet her, vil undgå behovet for fagecocktails, for hvilke den lovgivningsmæssige godkendelse kan være mere kompliceret. De resterende mål for fageudvikling er generiske for mange biologiske lægemidler, f.eks. stabilitet og respons fra immunsystemet. Det er især de fagocytiske celler, der er ansvarlige for at fjerne fagepartikler fra kredsløbssystemet. Mutanter af langcirkulerende fager blev fremstillet ved hjælp af en seriel passage-teknik58 og viste sig at være muteret i det vigtigste capsidprotein. Senere resulterede en enkelt aminosyreændring, også i et kapsidprotein, der blev indført ved direkte genetisk manipulation, i en 13.000-16.000 gange øget kapacitet for fagen til at forblive i musens kredsløbssystem59 . Andre parametre til forbedring af fager som terapeutiske midler, såsom produktion, formulering og administrationsvej, falder sandsynligvis uden for SB-aktiviteterne, men erfaringerne fra tidligere arbejde med indfødte fager vil også gælde for SB-manipulerede fager.

I løbet af det sidste årti med den fornyede interesse for fagterapi og sporadiske rapporter om vellykkede individuelle patienttilfælde har der været forsøg på at gennemføre kontrollerede kliniske forsøg, som ikke har resulteret i nogen væsentlige bivirkninger, men effektiviteten er stadig ikke blevet påvist eftertrykkeligt. Det vil være en spændende næste artikel i historien om fagterapi, som begyndte for over 100 år siden, at se SB-manipulerede fager indgå i kliniske forsøg.