Egenskaber og påvisning af botulinum neurotoksin
Clostridier producerer flere typer af proteintoksiner end nogen anden slægt af mikroorganismer. Clostridium botulinums enestående kendetegn er dets evne til at syntetisere et neurotoksin med en ekstraordinær styrke. BoNT’er omfatter en familie af farmakologisk ens toksiner, der binder sig til perifere kolinerge synapser og blokerer acetylcholinekocytose ved de neuromuskulære krydsninger. BoNT’er produceres i fødevarer, i tarmen og i kultur som progenitor-toxinkomplekser, der består af botulinalt neurotoksin, der er forbundet med ikke-toksiske proteiner. Det er blevet påvist, at de ikke-toksiske komponenter i komplekserne giver neurotransmitterne stabilitet og forhindrer inaktivering ved fordøjelsesenzymer i tarmen.
Diagnosen botulisme stilles generelt ved vurdering af kliniske symptomer hos patienter og ved fødevarebårne udbrud ved klynge af tilfælde, der involverer en gruppe af personer, som har spist en fælles fødevare. I de fleste undersøgelser af botulisme er det primære mål at påvise tilstedeværelsen af BoNT, da sporer af C. botulinum er vidt udbredt i miljøet og kontaminerer mange fødevarer. Påvisning af BoNT i blod, maveindhold og fødevarer bekræfter, at der er tale om botulisme. Isolering af C. botulinum fra en mistænkt fødevare, fra fæces fra spædbørn med botulismesymptomer eller fra sår giver dokumentation for diagnosen botulisme. Det giver dog ikke en bekræftelse i de fleste tilfælde, da der findes sporer i fødevarer og lejlighedsvis i fæces fra raske voksne.
BoNT påvises fortrinsvis ved hjælp af en bioassay af toksinet ekstraheret fra en fødevare eller klinisk prøve. Ekstraktet injiceres intraperitonealt i mus, og dyrene observeres med jævne mellemrum for typiske tegn på botulisme i op til fire dage. Afhængigt af mængden af BoNT observeres symptomerne på botulisme normalt inden for 4-24 timer. De karakteristiske symptomer omfatter nedsat bevægelighed hos dyrene, pelsraspning, åndedrætsbesvær, sammentrækning af mavemusklerne, hvilket giver en “hvepsemorfologi”, efterfulgt af kramper og død. Dyr, der viser disse tegn, dør normalt inden for 24-48 timer. Dyr, der dør tidligere end 2 timer eller efter 48 timer, bør anses for at være bukket under for andre stoffer end BoNT. Døden som følge af BoNT bekræftes ved neutralisering med serotypespecifikke antitoksiner.
Der forekommer ofte komplikationer ved bioassay af BoNT fra kliniske prøver og fra visse fødevarer i mus. Især dødsfald forårsaget af ikke-botulinum-interfererende stoffer er almindelige. Disse uspecifikke dødsfald kan generelt undgås ved at fortynde det interfererende dødelige stof til et slutpunkt, hvor døden forårsages af den mere potente BoNT. Undertiden kan der være mere end én serotype af BoNT i en prøve, der analyseres, og til bekræftelse heraf er det nødvendigt at neutralisere den med en blanding af antitoksiner. I forbindelse med fødevarer eller kliniske prøver kan dødsfald, der ikke skyldes botulinum, opstå som følge af infektion eller tilstedeværelse af endotoksiner. Infektiøse agenser kan fjernes ved membranfiltrering eller ved tilsætning af antibiotika til det ekstrakt, der skal testes. Ekstrakter, der indeholder endotoksiner, kan generelt fortyndes til et passende slutpunkt, eller endotoksinerne kan fjernes ved adsorption. Med ekstrakter fra ikke-proteolytiske stammer af C. botulinum (gruppe II) øges toksiciteten ved aktivering med en protease, f.eks. trypsin. I nogle fødevarer kan trypsin generere toksiske peptider, og derfor bør reaktionen afsluttes ved tilsætning af sojabønne-trypsinininhibitor efter 30-60 min.
Viable C. botulinum kan isoleres fra fødevarer ved berigelse i et egnet vækstmedium, f.eks. kogt kød-glucose-bouillon eller medier indeholdende peptoner, gærekstrakt og glucose. C. botulinum har komplekse næringsstofkrav og kræver et rigt medium til vækst. Med henblik på isolering er det ofte nyttigt at opvarme en del af fødevaren eller den kliniske prøve til 80° eller 60°C for at selektere for sporer af henholdsvis gruppe I og II C. botulinum. Lejlighedsvis anvendes 50% ethanol til inaktivering af vegetative celler i fødevareprøver, der analyseres for gruppe II C. botulinum. Efter berigelsen undersøges tilstedeværelsen af BoNT ved hjælp af et bioassay med mus som beskrevet tidligere. Selektive isolationsagar med antibiotika, herunder cycloserin, sulfamethoxazol og trimethoprim, er blevet anvendt til isolering af gruppe I C. botulinum fra kliniske prøver.
Der er udviklet en række immunologiske metoder til påvisning af BoNT, men de fleste er ikke så følsomme som musebioassayet, og de har også den potentielle ulempe, at de påviser biologisk inaktive BoNT. Der er gjort adskillige fremskridt inden for enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for at afhjælpe disse ulemper, og det er sandsynligt, at ELISA vil blive anvendt til at supplere, men ikke erstatte musebioassayet.