Minimum Inhibitory Concentration (MIC) og Minimum Bactericidal Concentration (MBC) testning definerer et testmaterials styrke i form af den koncentration, ved hvilken det vil hæmme væksten af (Minimum Inhibitory Concentration, eller MIC) eller dræber fuldstændigt (minimum bakteriedræbende koncentration eller MBC) 1 x 106 (en million) mikroorganismer i løbet af en 18-20 timers inkubationsperiode (35 ± 2 °C).
MIC-metoden måler virkningen af faldende koncentrationer af antiseptisk middel over en defineret periode med hensyn til hæmning af den mikrobielle populations vækst. Den koncentration af lægemiddel, der kræves for at frembringe virkningen, defineres som den mindste hæmmende koncentration og er normalt flere hundrede til tusind gange mindre end den koncentration, der findes i den færdige doseringsform.
Methods For Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests For Bacteria That Grow Aerobically
Den standardreference, der anvendes som grundlag for udførelse af bestemmelsen af den mindste hæmmende koncentration (MIC), er den nyeste version af Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically (i øjeblikket CLSI Doc. M7-A9, Clinical Laboratory Standards Institute ) eller anaerobt (CLSI Doc. M11-A8).
MIC & MBC Test Overview
Produktet fortyndes serielt 1:2 i et vækstmedium, der er egnet til at understøtte vækst af hver enkelt udfordringsmikroorganisme, normalt Mueller-Hinton Broth (MHB) eller Mueller-Hinton Agar (MHA), for at fremstille en fortyndingsserie af produkt i medium op til 1:32,768 (i henhold til BSLI SOP L-2045). Afhængigt af produkttypen er det dog muligt, at fortyndingsserien ikke udføres så langt. Til rørene i serien, der hver indeholder en alikvot på 2,0 mL af produktet, der er fortyndet i vækstmedium, tilsættes nu 1,0 mL af en 1 x 106 CFU/mL suspension af en udfordringsart. Efter 18-24 timers inkuberet eksponering undersøges rørene med suspensionen af udfordringsmikroorganismen/produktet/medium for at bestemme den højeste fortynding af produktet (og omvendt den laveste koncentration af produktet), der fuldstændig hæmmer mikroorganismens vækst, som det kan bestemmes med det blotte øje. Denne fortyndingsværdi (og/eller produktkoncentrationsværdi) registreres som den mindste hæmmende koncentrationsværdi.
Hvis der ønskes en MBC-bestemmelse, overføres målte mængder fra den fortyndingssuspension, der repræsenterer den mindste hæmmende koncentration, og fra de to eller tre fortyndingssuspensioner, der går forud for fortyndingen af den mindste hæmmende koncentration, til plader med fast vækstmedium, som derefter inkuberes i 24 timer ved 37E± 2E. Efter inkubationen undersøges pladerne for vækst af den pågældende mikroorganisme. Den fortynding af produktet (og/eller produktkoncentrationen), der ikke giver nogen vækst, registreres som MBC-værdien. Bemærk, at MIC/MBC-testprocedurer kan udføres ved hjælp af 1:2 serielle fortyndinger af produktet i næringsagarmedium (test i fast fase) eller ved hjælp af 1:2 serielle fortyndinger af produktet i næringsbouillonmedium (test i suspensionsfase). Medmindre sponsor specifikt kræver agarfortyndingsmetoden, vil BSLI udføre MIC-testningen ved hjælp af makrotube-bouillonfortyndingsmetoden, fordi den er langt mindre materiale- og tidskrævende.
Produkter testet under et Investigational New Drug
For produkter, der skal testes under et IND, specificerer FDA klart på side 31444 i TFM, hvilke mikroorganismer der skal anvendes til at udfordre produkterne in vitro. I forbindelse med undersøgelsen af den mindste hæmmende koncentration anføres det i TFM, at det færdige produkt, produktets aktive hovedstof og produktets bærestof hver især skal udfordres med 25 ATCC-stammer og 25 friske klinisk isolerede stammer af hver af de 12 Gram-negative og 11 Gram-positive bakteriearter og de to gærgrupper af arter (Candida albicans og Candida spp., ikke albicans). Der er således tale om en meget omfattende undersøgelse, der omfatter testning af 1 250 stammer af de i alt 25 bakterier og gærarter, der er specificeret i TFM, i forhold til hver af de tre produktkonfigurationer.
I de seneste år har FDA slækket lidt på dette byrdefulde krav – selv om det færdige produkt skal testes i forhold til de 1 250 stammer, skal produktets aktive hovedstof og produktvehikel som nævnt kun testes med fem ATCC-stammer og fem friske klinisk isolerede stammer af hver af de 25 bakterie-/gærarter. Alligevel er det i alt 250 stammer, der skal testes for både det aktive stof og vehikel, og den samlede TFM MIC-undersøgelse er ret omfattende og dyr – i alt 1 750 individuelle bestemmelser af minimumsinhibitoriske koncentrationer. FDA tillader også visse artsudskiftninger (f.eks. andre Bacteroides-arter end B. fragilis og andre arter af koagulase-negative Staphylococcus-arter end S. epidermidis, S. hominis, S. haemolyticus og S. saprophyticus) for at imødekomme knapheden på ATCC-stammer og/eller kliniske isolater af nogle af de arter, der kræves i TFM. I erkendelse af, at alkoholer generelt ikke er antimikrobielt aktive efter ca. to fortyndinger i forholdet 1:2, kræver FDA ikke MIC-data for produkter, hvor en alkohol er den eneste aktive komponent.
MIC & MBC Proof of Concept in Marketing Purposes
Og selv om BSLI har udført flere af de fuldstændige undersøgelser af mindste hæmmende koncentrationer, der kræves i henhold til TFM for IND-registrerede produkter, udføres størstedelen af undersøgelserne af mindste hæmmende koncentrationer og lejlighedsvise MBC-undersøgelser til proof-of-concept- og markedsføringsformål. I denne type undersøgelser anbefaler BSLI generelt kunderne, at ATCC-stammer af alle 25 arter/stammer, der er opført i TFM, plus et klinisk isolat af hver af dem, testes (dvs. i alt 50 udfordringsstammer).