Dybdeskarphed

Følgen af den numeriske blænde er, at den direkte relaterer til dybdeskarphed (DOF). For et givet objektiv, når man ser på en prøve, er der et bestemt plan med perfekt fokus. Skærpedybden er, hvor langt over og under dette plan objektivet og prøven kan være og stadig have alting i fokus.

Det samme sker i traditionel fotografering, en meget lille blænde vil øge dybdeskarpheden. En højere numerisk blænde vil give en højere opløsning, men dybden af feltet bliver betydeligt mindre. Der er en afstand over prøveplanet og en afstand under prøveplanet, og overalt inden for disse er der i princippet perfekt fokus. Så snart objektivet og prøven befinder sig uden for denne grænse, begynder billedet at blive sløret.

Dette kaldes dybdeskarphed. Formlen for dybdeskarphed er:

hvor:
“n” er brydningsindekset for materialet mellem objektivet og prøven
λ (lambda) er lysets bølgelængde
NA er den numeriske blændeåbning

I de fleste tilfælde er materialet mellem objektivet og prøven luft, og “n” er lig med 1,00. For vand er dets brydningsindeks 1,33, og specialiseret immersionsolie til mikroskopi er 1,52. For et objektiv med lav forstørrelse, f.eks. et 4X- eller endog 10X-objektiv, er den typiske dybdeskarphed plus eller minus 3 til 5 mikrometer. I så fald er det, hvis prøven er meget flad, måske slet ikke nødvendigt at fokusere, eller der behøver kun at ske en enkelt gang. Generelt set varierer prøverne i tykkelse, og de varierer i planhed, så fokusering er nødvendig.

For 20X forstørrelse, som kan være en numerisk blænde på 0,6 til 0,8, falder dybdeskarpheden til ca. plus eller minus 500 nanometer. Ved høj forstørrelse med olieimmersion ved en numerisk blænde på 1,47 falder dybden af feltet meget drastisk, og dybden af feltet kan være plus eller minus 0,1 til 0,2 mikrometer (100 – 200 nm). Det er en meget snæver tolerance. Ved 100 nanometer eller 200 nanometer vil meget små ændringer i prøvens planhed eller prøvens højde eller præcisionen af styreskinnerne i XY-prøvebevægelsesbordet gøre det vanskeligt at holde fokus. For at holde fokus i denne situation er et kontinuerligt sporende laserautofokussystem, der er forbundet med et objektivfokuseringstrin med høj båndbredde, som f.eks. DOF-5, den ideelle måde at holde fokus på i disse applikationer med høj numerisk apertur og høj opløsning.