Genitaltractus hos kvæg. A) Uterus (UT), æggestokken (OV) og oviductus (OD) er vist. B) Forstørrelse af det omkransede område i figur 1A viser tractus i detaljer, hvor ampulla og uterus-tubusforbindelsen kan identificeres.

Gammet-Oviduct Interactions

Fertilisationen finder sted i et specialiseret område af oviduct kaldet ampulla, hvor sædcellerne trænger ind i de ekstracellulære æggeskaller (cumulusceller og zona pellucida). Ankomsten af ægcellen og sædcellerne til æggelederen er ikke altid en synkroniseret begivenhed, da ægcellen hos nogle arter (f.eks. hund) frigives to eller tre dage før befrugtning, mens sædcellerne hos andre (f.eks. flagermus) er til stede i hunnens kønsorganer op til seks måneder før ægløsning (Holt, 2011). Følgelig giver oviductus-miljøet formodentlig et godt miljø for gametoverlevelse og -modning.

Oviductus kan udføre forskellige funktioner, fordi det har forskellige anatomiske regioner (figur 2) og en kompleks oviductal væske, der er dynamisk på grund af de ændringer, der produceres i løbet af østruscyklussen (Yañiz et al., 2006; Leese et al., 2008; Avilés et al., 2010). Denne kompleksitet er man for nylig begyndt at forstå takket være udviklingen af effektive analytiske instrumenter. For eksempel kan flere hundrede proteiner (spots) identificeres, når oviduktalvæsken analyseres biokemisk (figur 3). Ved hjælp af todimensionel elektroforese kan man få kvalitative og kvantitative oplysninger om de forskellige proteiner (antal og mængde af pletter), der findes i oviductalvæsken. Denne form for analyse kan påvise subtile ændringer (f.eks. fosforylering) i proteinerne afhængigt af brunstcyklus eller på grund af tilstedeværelsen af kønsceller. Overraskende resultater omfatter de ændringer, der finder sted i det oviduktale transkriptom som følge af tilstedeværelsen af kønsceller eller embryoner (Fazeli et al., 2004; Georgiou et al., 2007; Almiñana et al., 2012). Endnu mere specifikke ændringer blev observeret afhængigt af embryonets udviklingsstadie (firecelleembryo eller blastocyst), hvilket producerede en nedregulering af immunrelaterede gener, der påvirker livmoderen, selv før embryonets ankomst til dette organ (Almiñana et al., 2012). Desuden blev der også påvist ændringer ved tilstedeværelse af sædceller med et X- eller Y-kromosom (Almiñana et al., 2014). Udtrykket af gener (transkriptom) og proteiner (proteom) i oviduktet er fælles for flere arter, men de er ikke identiske, hvilket tyder på, at nogle funktioner er bevaret; det ser dog ud til, at nogle andre specifikke egenskaber er unikke for hver art (Bauersachs et al., 2003, 2004; Tone et al., 2008; Mondéjar et al., 2012). Dette bør tages i betragtning ved udviklingen af specifikke fortyndingsmidler og kulturmedier til forskellige arter.

Gametbeskyttelse og overlevelse

Det blev rapporteret, at tilstedeværelsen af oviductalvæske har en positiv effekt på sædcellernes levedygtighed (Killian, 2011), og at oviductalvæske tilfører de nødvendige næringsstoffer til oocytoverlevelse og enzymer med en antioxiderende effekt i oviductalvæske (Leese et al, 2008; Avilés et al., 2010). Disse enzymer er især relevante for sædcellerne, da de let beskadiges, når de udsættes for reaktive oxygenarter (ROS), der ændrer plasmamembranen (protein- og lipidperoxidation), hvilket kan føre til DNA-brud (Aitken og Luliis, 2010). Desuden betragtes sædceller i de kvindelige kønsorganer som fremmede celler, hvilket påvirker sædcellernes overlevelse på grund af immunologisk overvågning (Kawano et al., 2014). Hvordan denne proces reguleres, er endnu ikke afklaret, men hvad der ikke er tvivl om, er, at det oviduktale miljø beskytter sædcellerne. Bevis for dette kan findes i det faktum, at sædceller kan overleve i oviduktet fra en eller to dage i tilfælde af køer eller søer op til 6 mdr. i tilfælde af flagermus (Holt, 2011).

Oocytmodning i oviduktet

Det er blevet rapporteret, at oocyttens levetid i oviduktet er omkring 24 timer hos mennesker, hvilket er ens for de fleste af de arter, der er analyseret til dato. Hunden er dog speciel, fordi den oocyt, der frigives af æggestokkene på tidspunktet for ægløsning, er umoden og skal opholde sig mellem 2 og 3 d i oviduktet for at modnes før befrugtning (Tsutsui et al., 2009). Hos nogle arter er effektiviteten af in vitro-befrugtning (IVF) stadig lav, hovedsagelig på grund af utilstrækkelig standardisering af ART-teknikker (Mondéjar et al., 2012). To hypoteser relateret til oocytmodning i oviduct kan imidlertid overvejes for at forklare forskellene mellem in vivo og in vitro effektivitet af befrugtning: (i) De begivenheder, der sker i oviduct, er ikke fundamentale, men da de ikke forekommer under in vitro-procedurer, overlever kun oocytter af højeste kvalitet. Dette ville være årsagen til den lavere succesprocent ved ART sammenlignet med in vivo-begivenheder. (ii) De oocytter, der anvendes til in vitro-procedurer, er af lavere kvalitet end de oocytter, der fysiologisk æglægges og befrugtes i oviductet, hvilket resulterer i embryoner med ændringer i ikke-vitale, men vigtige egenskaber for deres sundhed i voksenalderen, såsom epigenetiske mærker (El Hajj og Haaf, 2013). Flere proteiner i oviduktalvæsken kan binde sig til oocyttens ekstracellulære kappe kaldet zona pellucida (ZP) og ændre både dens protein- og kulhydratsammensætning. Således blev det påvist, at oviduct-specifikt glycoprotein (OVGP1), osteopontin, prostaglandin D-syntase af lipocalin-typen og lactoferrin forbinder sig med ZP hos forskellige arter (Goncalves, et al., 2008). OVGP1 er det mest undersøgte ZP-associerede protein, og dets rolle i ZP-hærdningen før befrugtning, der reducerer polyspermi hos grisen, er blevet påvist (Coy et al., 2008).

Flere mekanismer, der deltager i sæd-ZP-bindingen og i den generelle befrugtningsproces (regulering af muligheden for polyspermi), moduleres af oviductet. Hvad angår ZP-hærdning før befrugtning, viste en række eksperimenter med oocytter fra ni arter og oviduktale væsker fra fem arter, at den korte inkubation af den ovariale oocyt med oviduktal væske medfører en klar ændring i ZP-modstandsdygtigheden over for enzymfordøjelse (Mondéjar et al., 2013). De opnåede resultater var imidlertid ikke identiske, hvilket indikerer en grad af specificitet, der kan skyldes (i) de forskellige proteinsammensætninger i oviductalvæsken eller endog en anden proteinsekvens kodet af det ortologt gen, som påvist for OVGP1 (Avilés et al., 2010) eller (ii) en anden ZP-sammensætning (protein og kulhydrat; Stetson et al., 2012). Nogle af forskellene mellem arter kunne endda skyldes fravær af protein, som det er tilfældet for OVGP1 hos hesten og rotten. Desuden er sædcellerne hos hesten ikke i stand til at befrugte oocytten in vitro; men når oocytten inkuberes med oviduktal væske fra svin eller oviduktal protein DMBT1, øges befrugtningsraten kraftigt (Ambruosi et al, 2013), hvilket viser oviduktussens relevans hos denne art.

Sædcellerne i oviduktet

Sædcellerne klæber til oviduktalepithelet i isthmusregionen. Denne binding er ansvarlig for dannelsen af et sædreservoir, der venter på tidspunktet for ægløsning. En sådan binding er ikke kun vigtig for at bevare sædcellernes levedygtighed, men også for at blokere for tidlig kapacitetsdannelse, hvilket ville kompromittere eller endog forhindre befrugtning. Frigivelsen af sædceller fra dette reservoir synes at blive formidlet af forskellige faktorer, herunder signaler formidlet af cumulus-oocytkomplekset (COC), oviductale komponenter, der ændrer sædbindingen, og også ændringer i progesteron- og østradiolniveauerne og hyperaktivering af sædcellernes motilitet (Suarez, 2006, 2008; Kölle et al, 2009; Talevi og Gualtieri, 2010; Coy et al., 2012).

De sædceller, der frigives på ejakulationstidspunktet, er ikke i stand til at befrugte oocytten og skal opholde sig i det kvindelige reproduktionstrakt, før de opnår evnen til at fuldføre befrugtningsprocessen. De forskellige biologiske ændringer, som sædcellerne gennemgår i kvindens kønsorganer, er kendt som kapacitation, en proces, der blev opdaget uafhængigt af Austin (1951) og Chang (1951) ved hjælp af kanin som dyremodel. Den detaljerede molekylære mekanisme, der er involveret i denne proces, er endnu ikke kendt, hovedsagelig fordi det er vanskeligt at fastslå, hvad der virkelig sker inde i æggelederen. De ændringer, der er observeret i sædcellerne, kan skyldes en omfordeling eller frigivelse af proteiner, selv om andre faktorer også kan være involveret (Yanagimachi, 1994; Florman og Ducibella, 2006). Det blev rapporteret, at sædcellerne ændres ved binding af forskellige oviduktale proteiner (osteopontin og OVGP1), som generelt øger sædcellernes levedygtighed, motilitet og kapacitering hos flere arter (Kan et al., 2006; Killian, 2011). OVGP1 er således ikke kun i stand til at binde ZP og sædcellerne, men er også i stand til at øge proteinfosforyleringen i sædcellerne, som er relateret til sædkapacitering (Kan et al., 2006). Andre mekanismer, der er involveret i kapacitering af kvæg- og svinesæd, er relateret til tilstedeværelsen af forskellige glykosidaser i oviduktalvæsken (Carrasco et al., 2008) og i oviduktale epitelier (Ma et al., 2012). Desuden blev frigivelsen af sialidase fra sædcellernes plasmamembran under kapacitering for nylig beskrevet (Ma et al., 2012). Disse glykosidaser kan modulere sædcellernes binding til det ovidektale epithel og dermed deres frigivelse fra sædreservoiret. For ganske nylig blev det for første gang beskrevet, at der findes en ny mekanisme, der er ansvarlig for specifikke ændringer, som formidles af små vesikler (exosomer) under sædcellernes transit gennem oviduktet (Al-Dossary et al., 2013). Nylige undersøgelser ved hjælp af genetisk modificerede mus har givet stærke beviser for relevansen af de kvindelige kønsorganer for sædets frugtbarhed (Kawano et al., 2010; Turunen et al., 2012). Sådanne modificerede mus er subfertile eller er ikke i stand til at befrugte oocytten ved hjælp af IVF-teknikker. Disse genetisk modificerede hanmus er imidlertid fertile in vivo. Det blev konstateret, at deres sædceller er i stand til at befrugte oocytten ved hjælp af IVF-teknikker, når de inkuberes med livmodersekret, en proces, der kan være medieret af exosomer, som beskrevet ovenfor (Kawano et al., 2010). Sekreter fra kvindelige kønsorganer kunne bruges til at forbedre sædbefrugtningskapaciteten in vitro i tilfælde af mænd med vigtig genetisk værdi, men ellers dårlig frugtbarhed.

Gamete- og embryotransport i oviduct

Gameter og embryoner skal være på det rigtige sted på det rigtige tidspunkt; følgelig yder oviduct et stort bidrag til denne proces. Sædcellerne skal nå frem til den oviduktale ampulla for at befrugte oocytten. Efter befrugtningen skal zygoten og de tidlige embryoner transporteres til livmoderen for at muliggøre implantation af blastocysten i endometrium (slimhinden i livmoderen). Den involverede mekanisme er dog ikke så enkel som forventet.

Oocyt- og embryotransport

Oocytter og embryoner er ubevægelige. Oocyterne er omgivet af et stort antal celler (cumulusceller) på tidspunktet for ægløsningen, når de danner en struktur kaldet cumulus oophorus, som indfanges af infundibulum (figur 2). De har ikke mulighed for at bevæge sig som sædcellerne, og de må transporteres passivt. Det er blevet rapporteret, at små ændringer i omfanget af cumulus-ekspansion påvirker cumulus-oocyt-kompleksernes indledende vedhæftning til epitelet i infundibulum, hvilket hindrer deres videre transport (Suarez, 2006). To væsentlige komponenter er involveret i transporten af oocytten til befrugtningsstedet: de koordinerede sammentrækninger af de glatte muskelceller (myosalpinx eller muskulært lag) langs oviductus’ længde og epitelcellernes ciliærslag (Figur 4). Hvis oviductus’ sammentrækninger er ændret, vil oocytten ikke nå frem til befrugtningsstedet hos mus (Dixon et al., 2009). Embryoner og oocytter transporteres med forskellig hastighed i hoppe- og rotte-ovidukten (Suarez, 2006). Således er det prostaglandin E2, der produceres af embryonerne, involveret i denne proces. For nylig blev det rapporteret, at embryoner inducerer en ændring i oviductal genekspression og dermed kan modulere deres eget miljø (Almiñana et al., 2012).

Sædtransport

På trods af det store antal sædceller, der frigives under ejakulation (mere end 40 millioner og 37.5 milliarder for henholdsvis menneske og vildsvin), er kun få sædceller i stand til at nå ampullen (100-1000 og 5000 for henholdsvis menneske og vildsvin), og et stort antal bliver kasseret (Harper, 1994; Hunter, 2012a; Suarez, 2006). Tilstedeværelsen af et reduceret antal sædceller på befrugtningsstedet betyder, at forholdet mellem oocyt og sædceller er tæt på 1:1. Dette er vigtigt, fordi mange sædceller ville øge polyspermien, hvilket er dødeligt for embryoner fra pattedyr (Hunter, 2012a). Den mekanisme, hvormed sædcellerne finder ægcellerne, er stadig ukendt. Nyere undersøgelser tyder på, at sædcellerne når befrugtningsstedet på grund af en kemotaxis- og/eller termotaxis-mekanisme (Eisenbach og Giojalas, 2006; Hunter, 2012b), processer, der ville være ansvarlige for at lede sædcellerne til den øverste del af oviductum. Det er blevet foreslået, at en kemisk gradient, som formidles af progesteron produceret af cumuluscellerne, er involveret (Eisenbach og Giojalas, 2006; Coy et al., 2012; Guidobaldi et al., 2012). Mus, der producerer denuded oviductal oocytter, befrugtes ikke in vivo; disse oocytter kan imidlertid befrugtes in vitro, hvilket tyder på relevansen af denne struktur for in vivo-situationen (Zhuo et al., 2001). Disse undersøgelser peger på relevansen af cumulus oophorus og minder os om, at data opnået ved hjælp af in vitro-modeller kræver omhyggelig fortolkning; desuden fremhæver de behovet for mere præcise in vitro-modeller, der efterligner in vivo-miljøet mere nøje. Indtil nu har fremskridtene på denne front været langsomme. Man kunne forvente, at sædcellernes indtrængen i oviductus var en relativt enkel proces, der var afhængig af muskulær kontraktion af livmoderen og sædmotilitet styret af kemo- eller termotaxis. Det er imidlertid blevet vist, at sædcellerne ikke er i stand til at krydse livmoderens tubusforbindelse, når et af sædcellernes proteiner (f.eks. ADAM3) er modificeret (Okabe, 2013). Det mangler stadig at blive opdaget, hvilken specifik molekylær interaktion der findes mellem sædcellerne og oviduktet, som gør det muligt for sædcellerne at komme ind i oviduktet.

Effekt af det oviduktale miljø på embryoudviklingen

Den kendsgerning, at embryoner kan fremstilles in vitro, og at donorer uden deres egne embryoner i livmoderen kan etablere en graviditet efter embryotransfer, underminerer oviduktets rolle. Det er imidlertid blevet påvist hos forskellige arter, at kvaliteten af den blastocyst, der opnås efter at embryonerne er blevet dyrket i oviductet, er bedre sammenlignet med de in vitro producerede embryoner, i det mindste med hensyn til morfologi, genekspression, kryotolerance og graviditetsrate efter overførsel (Rizos et al., 2007; 2010a; Mondéjar et al., 2012; Van Soom et al., 2014). Dette viser, at oviductus ikke er et organ, der blot er beregnet til at transportere zygoten/det tidlige embryo gennem livmoderen, men at der er en kommunikation mellem dem. De første stadier af embryonets udvikling sker i oviductus, hvor embryoet tilbringer omkring 4 til 5 d uafhængigt af den store forskel i oviductuslængden, der er observeret hos flere arter (sammenlign figur 1 og 2b; Suarez, 2006; Wang og Dey, 2006). I denne periode finder flere vigtige begivenheder sted, hvoraf den første er spaltningsprocessen og overgangen fra det maternelle genom til det embryonale genom. Enhver ændring af kulturmiljøet, der påvirker en af disse processer, kan have en dybtgående effekt på blastocystens kvalitet (Lonergan et al., 2003a). For nylig blev det rapporteret, at en ændring af kulturbetingelserne fra in vivo til in vitro eller omvendt på et specifikt tidspunkt i den tidlige embryonudvikling, enten før eller efter aktivering af det embryonale genom, har en kritisk indflydelse på genekspressionsmønstrene i de resulterende blastocyster (Gad et al., 2012). Desuden blev det oprindeligt observeret, at embryoklipning (celledelinger) er blokeret (tocellestadiet hos mus og ottecellestadiet hos ko), når in vitro-kulturbetingelserne ikke er optimale. Hos mus blev blokeringen af embryoudviklingen overvundet efter tilsætning af det oviduktale protein OVGP1 til kulturmediet (Yong et al., 2002). Flere eksperimentelle undersøgelser har vist, at oviduct af forskellige arter har lignende biologiske egenskaber, hvilket er i overensstemmelse med lignende transkriptomiske og proteomiske profiler (Mondéjar et al., 2012). Således kan oviduct fra en bestemt art anvendes til at forbedre embryonudviklingen hos en anden art i en proces, der er kendt som et hetorologisk forsøg. Ovidukter fra kvæg, mus, kaniner og får er blevet anvendt til embryokultur i heterologe eller homologe in situ-ovidukter for at producere embryoner af bedre kvalitet fra mange arter (Rizos et al., 2002a, 2010a; Lazzari et al., 2010). Enhver kommunikation mellem oviductus og embryonet er fint reguleret; hos kvæg udvikles f.eks. kun ét embryon in vivo, mens det in vitro er nødvendigt at dyrke embryoner i grupper for at opnå en højere blastocystudvikling (Goovaerts et al., 2009).