Abstract

Minimale hæmmende koncentrationer (MIC’er) og minimale fungicidale koncentrationer (MFC’er) blev bestemt for 38 olier af vegetabilsk oprindelse mod Candida albicans. Fire stammer, herunder en standardstamme, blev anvendt i denne undersøgelse. De svampedræbende midler fluconazol og amfotericin B blev anvendt som positive kontroller. Den standardstamme (ATCC10231), der blev anvendt i denne undersøgelse, viste sig at være meget resistent over for Fluconazol: Der skulle 3000 μg ml-1 fluconazol til for at hæmme væksten af denne stamme delvist, og der kunne ikke opnås fuldstændig hæmning. Andre Candida-stammer var følsomme over for 5 μg ml-1 fluconazol. Alle de anvendte stammer var følsomme over for amfotericin B. Af de 38 testede olier blev 23 fundet effektive, og 15 var ineffektive. På grundlag af deres MFC’er blev de effektive olier inddelt i tre kategorier. Syv olier, som udøvede fungicid virkning ved en koncentration af olier på mindre end 0,15 %, blev inddelt i den mest effektive klasse. De olier, der udviste MFC’er i intervallet 0,16-1,5 % koncentration, blev betragtet som moderat effektive. Ni olier, der krævede en koncentration på mere end 1,5 %, blev betragtet som mindre effektive. Den fluconazolresistente stamme (MTCC 227) var følsom over for mindst 23 af planteolierne. Resultaterne af denne undersøgelse tyder på, at olier af vegetabilsk oprindelse kan finde anvendelse som potentielle anti-Candida-midler.

1 Indledning

Amphotericn B og Fluconazol er to vigtige midler, der anvendes i antimykotisk kemoterapi mod humanpatogene svampe . Amphotericin B anvendes som det foretrukne lægemiddel til terminalt syge patienter . Azol-lægemidlet fluconazol er almindeligt foreskrevet mod forskellige Candida albicans-infektioner . Selv om disse lægemidler er meget anerkendte for deres effektivitet, er de kendt for at have bivirkninger . Fluconazol er fungistatisk af natur, og der er rapporter om fremkomst af fluconazolresistens blandt kliniske isolater af C. albicans. Der er således behov for bedre, nye svampedræbende midler mod infektioner forårsaget af C. albicans, som er effektive og har færre bivirkninger.

Mange naturlige midler som f.eks. planteprodukter, herunder ekstrakter, olier osv. anvendes traditionelt mod forskellige lidelser. Nogle af planteprodukterne er effektive mod svampe- og bakterieinfektioner . Æteriske olier som tea tree oil, citrongræsolie, citronellaolie, palmaroshaolie og nogle af deres bestanddele er blevet testet mod in vitro-vækst af C. albicans.

Vi har testet in vitro-effektiviteten af 38 planteolier mod fire isolater af C. albicans. Minimum inhibitoriske koncentrationer (MIC) og minimum fungicidale koncentrationer (MFC) for de effektive olier er rapporteret. Baseret på deres effektivitet (MFC) er olierne klassificeret i tre kategorier.

2 Materialer og metoder

2.1 Kemikalier og stammer

En standardstamme, typestamme ATCC10231 (MTCC 227/CA IV), en referencestamme foreslået til amfotericin B-assay, og tre kliniske isolater af C. albicans blev anvendt i denne undersøgelse. De tre kliniske isolater af C. albicans, dvs. SRTCC I (CA I), SRTCC II (CA II) og SRTCC III (CA III), blev indhentet fra SRTCC Culture Collection Center, School of Life Sciences, SRTM University, Nanded (MS). Indien. Standardstammen blev købt fra The Institute of Microbial Technology (IMTECH), Chandigarh, Indien.

Der blev anvendt otteogtredive planteolier i denne undersøgelse. Nogle af olierne blev venligst stillet til rådighed af Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants (CIMAP), Lucknow, Indien, og de resterende olier og de svampedræbende lægemidler, amfotericin B og fluconazol, blev købt på det lokale marked.

2.2. Fremstilling af inokula

Alle stammer af C. albicans, der blev anvendt i denne undersøgelse, blev dyrket ved 30 °C i 24 timer i en rystende inkubator ved hjælp af gærekstrakt-peptonmedium og Sabouraud Dextrose-medium. Cellerne blev høstet ved centrifugering, opslæmmet i sterilt destilleret vand og anvendt straks. Celtallet blev bestemt ved hjælp af et hæmocytometer og justeret til 5 × 106 cfu ml-1.

2.3 Screening af planteolier for anti-Candida-aktivitet ved diskdiffusionsassay

Den anti-Candida-aktivitet af 38 planteolier blev testet ved standard diskdiffusionsassay . Sabouraud Dextrose Agar-pladerne blev fremstillet og udsået med 5 × 106 cfu ml-1 ved hjælp af inokula af Candida-stammer fremstillet som ovenfor. Aseptisk blev 5 μl af planteolierne udtværet på 5-mm-filterpapirskiver (Whatman nr. 1). Disse skiver blev derefter overført til midten af de tilsåede plader. Der blev anvendt tre plader for hver koncentration, og de blev inkuberet ved 30 ± 2 °C. Diameteren af hæmningszonen blev målt efter 48 timers inkubation.

2.4 Bestemmelse af mindste hæmmende koncentration (MIC) af planteolier ved agarfortyndingsmetoden

Minimale hæmmende koncentrationer (MIC) af planteolier blev bestemt ved agarfortyndingsassay (23) Agarpladerne blev fremstillet ved at tilsætte YPD agar indeholdende forskellige koncentrationer af planteolier (dvs. 0,03-3% v/v). Tween 20 0,5 % (v/v) blev tilsat for at øge olieopløseligheden. Disse plader blev inokuleret med 103 cfu ved hjælp af de inokula af Candida-stammer, der var fremstillet som ovenfor. Pladerne blev opbevaret i tre eksemplarer for hver koncentration. Plader med Tween 20, men uden planteolie, blev anvendt som kontrol. Alle disse plader blev inkuberet ved 30 ± 2 °C. Pladerne blev observeret, og antallet af kolonier blev talt efter 48 timers inkubation. MIC-værdierne blev bestemt som den laveste koncentration af olie, der forhindrer synlig vækst af Candida-stammer.

2.5 Bestemmelse af minimum fungicid koncentration (MFC) af planteolier ved hjælp af Broth-makrofortyndingsmetoden

Minimum fungicid koncentration (MFC) af planteolier blev bestemt ved hjælp af Broth-makrofortyndingsassay (NCCLS M27-A, referencemetode anbefalet til undersøgelse af svampedræbende modtagelighed for gær) . Et interval af koncentrationer (0,03-3% v/v) af planteolie blev fremstillet i YPD-bouillonmedium i kolber. Tween 80 blev tilsat i en slutkoncentration på 0,001 % (v/v) for at øge olieopløseligheden. Hver kolbe blev inokuleret med 5 × 105 cfu ml-1 af Candida-stammerne. Kolber, der indeholdt Tween 20, men ikke indeholdt nogen planteolie, blev anvendt som kontrol. Kolberne blev inkuberet ved 30 ± 2 °C i en orbital rystende inkubator (100 rpm) i 48 timer. 5 μl af kulturen fra hver kolbe blev inokuleret på YPD-plader og inkuberet ved 30 ± 2 °C i 48 timer. Pladerne blev observeret, og MFC’er blev bestemt som den laveste koncentration af planteolien, der fuldstændig hæmmer væksten af Candida-stammer.

3 Resultater

3.1 Screening af planteolier for anti-Candida-aktivitet

De testede isolater af C. albicans viste forskellig følsomhed over for olierne. Størstedelen af olierne blev dog fundet effektive og viste betydelig aktivitet ved meget lave koncentrationer. Femogtyve ud af de 38 testede olier forårsagede en hæmningszone (ZOI) på 1-30 mm. Sytten olier forårsagede en 10-20 mm ZOI. Seks olier viste en ZOI på 1-9 mm mod alle fire testede stammer. Jasmin- og lavendelolie kunne ikke hæmme væksten af Candida-stammerne undtagen CA IV. (tabel 1). (13 olier kunne ikke hæmme væksten af C. albicans-stammerne ved 5-μl-doser.)

3.2 Bestemmelse af MIC af planteolier mod C. albicans

MIC’er af de 23 effektive olier og to almindeligt foreskrevne lægemidler, fluconazol og amfotericin B, blev bestemt mod de fire isolater af C. albicans. Olierne udviste koncentrationsafhængig hæmning af væksten. I nogle få tilfælde viste de testede stammer forskellig følsomhed, men der var ingen betydelig forskel i MIC (tabel 2).

Alle fire isolater viste sig at være følsomme over for amfotericin B. En koncentration på 2,5 μg ml-1 af amfotericin B var tilstrækkelig til at hæmme væksten af stamme CAI og stamme CA IV (ATCC10231) fuldstændigt. Stamme CA II og CA III krævede 3 μg ml-1 amfotericin B for total væksthæmning (tabel 2).

Svaret på fluconazol viste sig at være divergerende. Stamme Ca III var den mest følsomme, og kun 2 μg ml-1 koncentration af fluconazol var nok til fuldstændig væksthæmning. Stammerne CA I og CA II krævede 5 μg ml-1 fluconazol () for at opnå fuldstændig væksthæmning (tabel 2). Stamme CA IV var meget resistent over for fluconazol: Der skulle 3 000 μg ml-1, dvs. 1 500 gange MIC for stamme CA III, til for at opnå en delvis væksthæmning. Fuldstændig væksthæmning kunne ikke opnås hos denne stamme, selv ikke ved en meget høj koncentration.

En 0,01 % koncentration af kanelolie var nok til at hæmme væksten af alle fire isolater fuldstændigt. Jasmin- og lavendelolier forårsagede kun en lille væksthæmning og kunne ikke hæmme væksten fuldstændigt. Syv olier hindrede væksten af C. albicans-stammerne fuldstændigt i et koncentrationsområde på 0,03-0,15 %. For 11 olier varierede MIC fra 0,16 % til 1,0 % Fem olier krævede en koncentration på mere end 1,0 % (tabel 2 og 3).

3.3 Bestemmelse af planteoliernes MFC mod C. albicans

Minimal fungicid koncentration (MFC) er defineret som den laveste koncentration af olie, der resulterer i, at 99,9 % af inokulumet dør. Alle de olier, der hæmmer væksten, udviste fungicid aktivitet med undtagelse af jasmin- og lavendelolier. Generelt blev det observeret, at den fungicide koncentration var højere end MIC, undtagen i nogle få tilfælde som f.eks. pebermynte-, geranium-, ocimum-, nellike- og ingefærolie, som forårsagede døden af 99,9 % af inokulumet ved MIC. I henhold til deres MFC mod ATCC10231 kunne de effektive olier inddeles i tre klasser. De olier, der forårsagede svampedræbende virkning ved en koncentration på 0,03-0,15 %, betragtes som de mest effektive (ME). De olier, der kræver en koncentration på 0,15-1,0 %, indgår i den moderat effektive gruppe (MoE). De, der blev fundet svampedræbende ved en koncentration på mere end 1,0 %, betragtes som mindre effektive (LE).

Syv olier blev fundet mest effektive (ME) (tabel 2 og 3). Kanelolie var den bedste, idet den havde fungicid virkning ved 0,03 % koncentration på alle fire isolater af C. albicans. Fed olie var fungicid ved en koncentration på 0,12%, og der var ingen forskel mellem MIC og MFC. I de fleste ME-olier var der behov for en 2-4 gange MIC for at opnå fungicid virkning. Candida-isolaternes reaktion på nogle medlemmer af denne gruppe var divergerende, dvs. hos stamme CA II i tilfælde af japansk mynteolie og ingefærgræsolie, CA III i tilfælde af citrongræsolie og CA IV i tilfælde af ingefærgræsolie (tabel 2).

Peppermint- og tea tree-olie var de bedste blandt gruppen af syv ME-medlemmer, idet de forårsagede fungicid virkning ved 0,25 % koncentration (tabel 3). Tulsiolie var fungicid ved en koncentration på 0,5 %, 1 % var MFC for kamfer-, citron-, ocimum- og ylang-ylang-olier. Der blev også fundet en forskel i følsomhed for nogle få medlemmer af denne gruppe. Der var behov for to gange MIC for disse olier med undtagelse af pebermynte- og Ocimum-olie (tabel 2).

Nine olier viste sig at være mindre effektive (tabel 3). Disse olier krævede mere end 1,0 % for at udøve fungicid virkning. MFC for disse olier varierede fra 1,0 % til 3 % undtagen for jasmin-, ingefær- og enebærolie, som ikke var fungicid op til en koncentration på 3 %. CA II og CA III viste forskellig følsomhed (tabel 2 og 3).

4 Diskussion

Anti-Candida-aktivitet af nogle af de æteriske olier som Tea tree oil er velkendt . Mange af de præparater, der anvendes mod vaginal candidiasis forårsaget af C. albicans, indeholder Tea tree oil som en aktiv komponent . Flere olier af vegetabilsk oprindelse er blevet foreslået i alternativ medicin mod mikrobielle infektioner, herunder candidiasis og gingivitis . Azol-svampemidler og derivater er dog fortsat dominerende som foretrukne lægemidler mod Candida-infektioner, som topiske anvendelser eller som orale lægemidler . Bortset fra tea tree oil, som har været anvendt i Australien i mere end 80 år, er der ikke kommet mange urteprodukter på markedet . Nogle produkter, der indeholder rosmarinolie, anvendes mod svampe, der forårsager skæl . Der er rapporteret om in vitro anti-candida-aktivitet af æteriske olier som tea tree, citrongræs, citronella, pebermynte og palmarosa . Vi har undersøgt effektiviteten af 38 olier af vegetabilsk oprindelse med hensyn til in vitro anti-Candida-aktivitet mod fire isolater af C. albicans (tabel 1 og 2). Mindst 23 af de testede olier viste sig at være lovende som effektive midler. Disse olier kunne klassificeres i henhold til deres effektivitet (tabel 3). Et af isolaterne, som viste sig at være resistent over for fluconazol, blev hæmmet ved meget lave koncentrationer af alle de effektive olier af vegetabilsk oprindelse, der blev testet i denne undersøgelse (tabel 2).

Disc diffusion assay er en standardmetode, der i vid udstrækning anvendes til hurtig screening af naturprodukter for antimykotisk aktivitet . Vi har screenet planteolier ved hjælp af denne meget bekvemme forsøgsmetode. Denne undersøgelse viser, at der er behov for forsigtighed, da forskellige olier kan have forskellige diffusionshastigheder på agarplader, og dette kan bidrage til variation i de hæmmende zoner, hvilket kan føre til fejlagtige konklusioner vedrørende deres svampehæmmende aktivitet. F.eks. var nogle af de olier, som udviste mindre hæmningszoner end andre, meget effektive mod Candida-stammer i NCCLS-bouillonfortyndingsassayet, som ikke omfatter diffusion. F.eks. udviste kanelolie en ZOI på 24 mm i diskdiffusionsassayet, mens citrongræsolie udviste 30 mm. Men i MFC-assayet blev kanelolie (0,01 %) fundet bedre end citrongræsolie (0,06 %). Fungicid aktivitet betragtes som en ønskværdig egenskab for svampedræbende midler, da den kan fjerne svampen fuldstændigt fra vævene. Amphotericin B er svampedræbende, er kendt for at være meget effektivt mod humanpatogene svampe og anvendes som det foretrukne lægemiddel ved systemiske svampeinfektioner på trods af dets alvorlige bivirkninger . Fluconazol, som er det hyppigt ordinerede svampedræbende middel mod Candida-infektioner, er fungistatisk af natur og kan kræve langvarig brug .

Det er opmuntrende at bemærke, at størstedelen af de olier, der blev anvendt i denne undersøgelse, var fungicidale ved lave koncentrationer. Der findes ikke mange oplysninger om virkemåden for de naturprodukter, der hæmmer Candida-vækst. Flere Fluconazol/azol-resistente stammer skal inkluderes i fremtidige undersøgelser. Planteolierne kunne finde anvendelse som anti-Candida-midler mod azolresistente stammer. De fleste af de olier, der er anvendt i denne undersøgelse, har længe været anvendt i fødevarer, konfekturevarer og som bestanddele i parfume . Men hvis de skal overvejes i aktuelle præparater, skal der foretages en omhyggelig undersøgelse af deres sandsynlige irriterende og andre uønskede virkninger på mennesker.

Anerkendelser

Authorerne er taknemmelige over for Dr. S.A. Suryawanshi, Hon’ble Vice Chancellor, SRTM University, Nanded (MS) Indien, for opmuntring.