Diskussion

I den foreliggende undersøgelse viste vi, at MR og GR er til stede i rotte binyrebarkhinde. Vi viste, at ændring af MR-aktiviteten regulerer aldosteronproduktionen i ZG på en måde, der passer til en negativ feedback-mekanisme. Denne effekt er specifik for MR, da modulering af aktiviteten af GR i ZG ikke havde nogen effekt på aldosteronproduktionen. Så vidt vi ved, er det første gang, at MR-ekspression og dens rolle i reguleringen af aldosteronsekretionen i binyrebarken er blevet rapporteret. I ZF/ZR observerede vi et lignende feedbackloop, da vi farmakologisk modificerede GR’s aktivitet. Interessant nok undertrykte MR-aktivering også kortikosteronsekretionen i ZF/ZR-celler. Vores resultater er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, der viser, at binyrernes glukokortikoid-syntese kan moduleres af steroider, der syntetiseres i binyrebarkhinde (Baird et al. 1983, Carsia & Malamed 1983, Darbeida & Durand 1987).

MR-aktivering med FLUDRO udøvede en negativ virkning på aldosteronproduktionen i ZG-celler fremstillet fra rotter, der blev holdt på både HS- og LS-diæt, mens canrenoic acid, en MR-antagonist, regulerede steroidogenesen positivt med en stigning i aldosteronsekretionen i ZG-celler fra LS-fodrede rotter. Vi så et mere udtalt respons i LS-grupperne sammenlignet med responsen i HS-grupperne. Den manglende effekt af en GR-agonist og -antagonist på basal og stimuleret aldosteronfrigivelse fra ZG-cellerne tyder i høj grad på, at det regulerende feedbackloop er receptorspecifikt.

Hvad kan være den fysiologiske og kliniske relevans af et ultrakort feedbackloop for aldosteron? Der er et tæt forhold mellem aldosteronproduktion og miljøfaktorer, f.eks. natrium- og kaliumindtag, kropsholdning, tidspunkt på dagen og volumetab. Det er længe blevet fastslået, at uhensigtsmæssige niveauer af aldosteron i forhold til niveauet af disse miljøfaktorer fører til en række kardiovaskulære og metaboliske sygdomme hos mennesker og andre dyr. Derfor er kritisk følsomme negative feedback-sløjfer vigtige for opretholdelsen af normal homøostase. Dette er særlig relevant for volumen/natrium-homeostase, da selv en mindre fejljustering af reaktionerne på ændringer i det miljømæssige natriumindtag over tid kan føre til betydelige negative kardiovaskulære virkninger. Disse potentielle konsekvenser er sandsynligvis grunden til, at der er flere kontroller og balancer i de systemer, der regulerer volumen/natrium-homeostase, f.eks. renin-angiotensinsystemet, aldosteron, natriuretiske peptider, endothelin, vasopressin og nyrerne (nyreblodgennemstrømning, proximal tubulus, Henle-loop og distal tubulus/samlingsgang). Disse reguleringsfaktorer styres delvist af: (1) “lange” negative feedback-løkker, f.eks. volumen-renin-angiotensin-aldosteron negativ feedback-løkke; (2) virkningsretning af modsatvirkende faktorer, f.eks. natriuretiske peptider, der undertrykker aldosteronsekretion og (3) ultrakorte feedback-løkker, f.eks. direkte undertrykkelse af reninfrigivelse fra det juxtaglomerulære apparat ved angiotensin II’s interaktion med angiotensinreceptor-type 1. I nogle henseender er ultrakorte feedback-loops’ funktioner analoge til det næsten universelle koncept om produkthæmning af enzymfunktion. Parallelt med angiotensin II’s virkning støtter den aktuelle undersøgelse hypotesen om, at der også findes et ultrakort feedbackloop, som ændrer aldosteronproduktionen på det sted, hvor den endelige syntese finder sted, ved hjælp af aldosteronniveauet og MR. Dette trin forfiner yderligere produktionen af aldosteron for at sikre, at den er passende for det miljø, som organismen befinder sig i på det pågældende tidspunkt. Det giver naturligvis også endnu et punkt i disse volumenhomeostatiske mekanismer, hvor dysfunktion kan føre til kardiovaskulær dysfunktion og sygdom. To rapporter er potentielt relevante for disse muligheder. I modsætning til de foreliggende undersøgelser i normale ZG-celler, hvor RU 486 ikke havde nogen virkning på aldosteronsekretion, undertrykte RU 486 i to ændrede forhold, primære aldosterontumorceller (Burton et al. 2011) og Zucker-obersyge hypertensive rotter (Clapham & Turner 1997), plasmaaldosteron-, men ikke plasmakortikosteronniveauer. I lighed med den foreliggende undersøgelse ændrede RU 486 ikke aldosteronniveauet hos kontrolrotter (Clapham & Turner 1997). Af interesse var det, at MR-antagonisterne i tumorcellerne ikke havde nogen virkning på aldosteronproduktionen. Der blev ikke foretaget aktivering af MR. Da der blev fundet lignende niveauer af aldosteron og kortisol i cellepræparaterne, var der tale om celleblanding, eller der var tale om en ændret celletype (Burton et al. 2011). Endelig kan resultaterne af den foreliggende undersøgelse være anvendelige til regulering af steroider uden for binyrerne med deres sandsynlige fysiologiske og kliniske relevans.

Hvordan ændrer ændringer i MR-aktivitet aldosteronsekretionen? Stigningen i kortikosteronsekretion med en samtidig undertrykkelse af aldosteronproduktionen tyder på, at den sene vej i aldosteronbiosyntesen er stedet for regulering. Det sidste trin i aldosteronsyntesen er afhængig af CYP11B2’s aktivitet (aldosteronsyntase) (Mornet et al. 1989). Faldet i omdannelsen af corticosteron til aldosteron skyldes højst sandsynligt en nedsat aktivitet af CYP11B2 og ikke en ændring i CYP11B2-ekspressionen på grund af den korte varighed (1 time) af vores forsøg. Vores fund af nedsatte CYP11B2-proteinniveauer under HS-betingelser og den foreslåede mekanisme for modifikation af CYP11B2-aktivitet ved MR forklarer sandsynligvis svækkelsen af det regulerende feedbackloop på en kost med højt saltindhold.

Lavt natriumindtag er en velkendt stimulator af aldosteronsekretion (Marusic & Mulrow 1967, Aguilera & Catt 1979), og vores resultater er i overensstemmelse med disse rapporter. Vi observerede en forhøjelse af serumkortikosteron med en saltrig diæt. I overensstemmelse med en stigning i serumkortikosteron viste isolerede ZF/ZR-celler fra rotter på en saltrig diæt en højere basal kortikosteronsekretion. De mekanismer, hvormed diætnatrium påvirker corticosteronsekretionen, er ikke blevet undersøgt, selv om tidligere undersøgelser har vist, at binyrerne hos rotter med natriummangel har nedsat sekretion af corticosteron (Eisenstein & Strack 1961). Corticosteron kan produceres af både ZF/ZR og ZG, selv om størstedelen af det cirkulerende corticosteron kommer fra ZF/ZR på grund af deres væsentligt større masse. Da den basale kortikosteronfrigivelse fra ZG-celler ikke blev påvirket af ændringer i kostens natriumindtag, udledte vi imidlertid, at ZF/ZR-cellerne bidrog til stigningen i serumkortikosteron ved højt natriumindtag.

Eksistensen af et intra-adrenal feedback loop, der udøves af glukokortikoider og GR til regulering af glukokortikoidproduktionen, er længe blevet foreslået af flere in vivo- (Peron et al. 1960, Hill & Singer 1968) og in vitro-undersøgelser (Morrow et al. 1967, Carsia & Malamed 1983). Disse undersøgelser rapporterer kontrasterende resultater med hensyn til, om glukokortikoider hæmmer eller stimulerer glukokortikoidproduktionen. Reguleringsretningen synes at afhænge af den anvendte eksperimentelle model og behandlingens varighed. I denne undersøgelse giver vi beviser for en negativ regulerende feedback på kortikosteronsekretion i overensstemmelse med Carsia & Malameds (1983) resultater, selv om andre forskere har rapporteret modsatte resultater (Darbeida & Durand 1987, Li et al. 2011, Asser et al. 2014). På trods af den store mængde arbejde er de mekanismer, hvormed glukokortikoider regulerer steroidogenese, ikke godt forstået. Vores resultater, der viser en markant depression i kortikosteronsekretionen kun i ACTH-stimulerede ZF/ZR-celler ved DEX-behandling, er i overensstemmelse med Latner og kollegers resultater (Latner et al. 1977), som antyder, at glukokortikoider nedsætter ACTH’s binding til sin receptor. Desuden påvirkede glukokortikoidantagonisten RU 486 ikke den basale kortikosteronsekretion, men stimulerede kortikosteronproduktionen ved hjælp af ACTH. Disse data peger på muligheden for, at GR-aktivitet modificerer ZF/ZR-cellernes følsomhed over for ACTH. Andet arbejde med længere inkubationstider tyder på, at glukokortikoider hæmmer proteinsyntesen og regulerer transkriptionen på flere målgener i binyrebarkhinde (Morrow et al. 1967, Asser et al. 2014). Selv om denne forklaring synes usandsynlig i vores undersøgelse på grund af varigheden af vores eksperimenter, kan vi ikke udelukke muligheden for, at genomiske effekter kan have bidraget til vores observationer.

Et overraskende fund i vores undersøgelse var, at ZF/ZR i modsætning til ZG ikke demonstrerer receptorspecificitet. Aktivering af GR eller MR kan undertrykke corticosteronproduktionen i ZF/ZR. MR-aktivering er blevet rapporteret til at modulere glukokortikoidproduktionen, men denne effekt er kun påvist i hjernen. Administration af fludrocortison hos mennesker viste sig at hæmme kortisolkoncentrationerne ved nedregulering af den hypothalamisk-hypofyseakse (HPA) (Otte et al. 2003, Buckley et al. 2007, Lembke et al. 2013). MR’s klare indflydelse på glukokortikoid HPA-feedbackkontrol blev yderligere påvist, da det blev vist, at canrenoic acid havde en modsatrettet effekt på kortisol- og ACTH-sekretion (Arvat et al. 2001, Wellhoener et al. 2004). Vores resultater tyder på, at ud over at MR-aktiviteten centralt regulerer glukokortikoidproduktionen, kan den også regulere den lokalt i binyrerne, selv om reguleringen tilsyneladende afhænger af niveauet af saltindtag. På begge diæter som svar på ACTH hæmmer MR-aktivering corticosteronproduktionen, men af uklare årsager synes den på den saltfattige diæt at øge corticosteronniveauet. I betragtning af at in vivo er binyrernes blodgennemstrømning fra ZG til ZF/ZR, kunne aldosteron have parakrin virkning på glukokortikoidproduktionen med interessante fysiologiske og patofysiologiske implikationer.

En begrænsning i undersøgelsen var, at kontaminering mellem glomerulosa- og fasciculata-zoner potentielt kunne skjule ændringer i respons på forskellige stimuli. Vi mener, at dette er usandsynligt baseret på fraværet af CYP11B2 i ZF/ZR og mikroskopiske data, hvor ZF/ZR- og ZG-cellerne har tydeligt forskellige karakteristika, viste lidt eller ingen kontaminering i de to cellepræparater. En anden begrænsning er, at den foreliggende undersøgelse ikke kan vurdere den relative betydning af disse parakrine virkninger i forhold til de klassiske endokrine virkninger, der kontrollerer binyrebark steroidogenese. En tredje begrænsning er, at vi ikke ved, om kortisol eller kortikosteron ved at interagere med MR kan have den samme virkning som aldosteron. Men som tidligere nævnt ville det i betragtning af blodstrømmens retning fra glomerulosa- til fasciculata-zoner, hvis det skete, ikke være en lokal, parakrin virkning. For det fjerde kan vi ikke udelukke muligheden for krydsreaktivitet mellem MR-agonisten og -antagonisten med GR. Selv om fludrocortison er kendt for at udøve en vis glukokortikoid aktivitet, er dets affinitet for MR 15 gange højere end for GR (Agarwal et al. 1977). Der er ikke blevet rapporteret om interaktion mellem canrenoic acid og GR i nogen dosis, som vi kender til. For det femte kan vi, når vi ikke har set en virkning af en manipulation på basal steroidproduktion, ikke med sikkerhed konkludere, at der ikke er nogen, da en lige så plausibel fortolkning ville være, at vores assay-systemer ikke er følsomme nok til at opfange små virkninger. Endelig er ekstrapolering af disse rotteundersøgelser til mennesker usikker.

Sammenfattende støtter den foreliggende undersøgelse, ud over de klassiske, lange feedbacksløjfer, der regulerer binyrebarksteroidproduktionen, hypotesen om, at der er negative ultrakorte reguleringsløjfer, der formidles specifikt af MR på aldosteronsekretion og GR på kortikosteronproduktion i henholdsvis isolerede ZG- og ZF/ZR-celler. Vi rapporterer her det uventede resultat, at MR-aktivering også negativt regulerer glukokortikoidsekretionen i ZF/ZR-celler. Det er uvist, hvordan disse korte feedbacksløjfer interagerer med deres lange feedbacksløjfer. Disse fund rejser imidlertid spændende spørgsmål vedrørende den fysiologiske regulering og den potentielle patofysiologiske dysregulering af produktionen af disse steroider.