Kanalens sluser fungerer ved hjælp af gravitationsstrømmen af vand fra Gatún-, Alajuela- og Miraflores-søerne, som tilføres vand fra Chagres-floden og andre floder. Selve sluserne er af ensartet længde, bredde og dybde og blev bygget parvis for at muliggøre samtidig passage af skibe i begge retninger. Hver sluseporte har to fløje, der er 20 meter brede og 2 meter tykke, og som er monteret på hængsler. Portene er mellem 14 og 25 meter høje og bevæges af elmotorer, der er indbygget i slusevæggene. De betjenes fra et kontroltårn, som er placeret på den væg, der adskiller hvert slusepar, og hvorfra man også styrer oversvømmelsen eller tømningen af slusekamrene. Slusekamrene er 300 meter lange, 33 meter brede og 12 meter dybe.

På grund af de originale slusemekanismers skrøbelige karakter er det kun små fartøjer, der kan passere gennem sluserne uden hjælp. Større fartøjer styres af elektriske slæbelokomotiver, som kører på tandhjulsspor på slusens vægge og tjener til at holde skibene centreret i slusen. Før man kan sejle ind i en sluse, skal man passere en fenderkæde, der er spændt ud mellem væggene i indsejlingen. Hvis alt forløber korrekt, falder denne kæde ned i sin rille i bunden af kanalen. Hvis skibet tilfældigvis bevæger sig for hurtigt til, at det er sikkert, vil kæden forblive strakt, og skibet vil køre imod den. Kæden, som betjenes af et hydraulisk maskineri i væggene, vil derefter langsomt blive frigjort ved automatisk udløsning, indtil skibet er bragt til standsning. Hvis skibet skulle slippe væk fra slæbelokomotivet og ved at bryde igennem kæden ramme den første port, vil en anden port 15 meter væk beskytte slusen og standse yderligere fremrykning.

De tredje slusesystemer i projektet Third Set of Locks, der blev påbegyndt i 2007, er inspireret af Berendrecht-slusen i Antwerpen, Belgien, og af vandbesparende bassiner, der anvendes i kanaler i Tyskland. Omkring 190.000 tons stål, hovedsagelig fra Mexico, er indlejret i stærkt armeret beton for at bygge slusekamrene på Atlanterhavs- og Stillehavssiden, og de nye sluseporte måler op til 10 meter i bredden, 30 meter i højden og 58 meter i længden. De nye slusekamre og bassiner, som skal kontrollere vandet fra Gatún-søen, er designet med henblik på at minimere turbulensen i vandstrømmen og forstyrrelsen af de skibe, der passerer. Bassinerne blev færdiggjort i juni 2016 og omfatter 158 ventiler bestående af 20.000 tons strukturelt materiale. Myndighederne siger, at disse vandbesparende bassiner er de største i verden og muliggør en genanvendelse af vand på 60 procent. Mens de eksisterende sluser bruger 52 millioner gallon (197 millioner liter) ved hver brug, bruger de nye sluser 48 millioner gallon (182 millioner liter).