En ukompetitiv hæmmer er en hæmmer, der kun binder sig til enzym-substrat-komplekset. Dets bindingssted dannes først, når enzymet og substratet har interageret indbyrdes. Den ukompetitive hæmning virker ikke, når yderligere substrater forsøger at være involveret. Enzym-substrat-inhibitor-komplekset danner ikke noget produkt
E + S -> ES
ES + I -> ESI -X-> E + P
Ukompetitiv hæmmer binder sig til enzym-substrat-komplekset for at forhindre enzym i at reagere med substratet og danne produkt, som sådan virker den godt ved højere substrat- og enzymkoncentrationer, som substrater er bundet til enzymer; bindingen resulterer i faldende koncentration af substratbinding til enzymet, Km og Vmax og stigende bindingsaffinitet af enzymet til substratet.
E + I -> (gennem S) ES + I -> E + P
hvor E er enzymet, I er inhibitoren, ES er enzym-substratkomplekset, og P er produktet.
Denne binding af substratet ændrer enzymets struktur og gør det hæmmende bindingssted for inhibitoren tilgængeligt. Ukompetitiv hæmning nedsætter den maksimale hastighed såvel som KM. K,M er koncentrationen af substratet, når hastigheden er halvdelen af den maksimale hastighed baseret på Michaelis-Menten-kinetikmodellen. Både Vmax og KM reduceres med lige store mængder. Vmax vil stadig blive reduceret, selv om bindingen mellem enzym og substrat er øget, fordi der dannes ESI-komplekser. ESI-komplekser hæmmer dannelsen af produktet. En ukompetitiv inhibitor vil sænke KM og skabe en bedre enzym-substratbinding, fordi den kun binder til ES-komplekset. Men ES-komplekset bliver konstant udtømt, efterhånden som inhibitoren binder sig, hvilket danner ESI-komplekser. For at opretholde ligevægten mellem ES- og ESI-komplekser og i overensstemmelse med Le Chateliers princip forskydes reaktionen derfor i retning af mere ES-dannelse, hvor den vil binde mere substrat til enzymerne for at skabe mere ES. I sidste ende fører dette til en lavere KM. En reduceret KM indikerer en bedre enzym-substratbinding, fordi enzymet kan nå halvdelen af sin maksimale hastighed med mindre substratkoncentration. På en måde er enzym-substratbindingen meget effektiv, fordi enzymet og substratet har en høj affinitet og interagerer stærkt.