Abstract

Vi undersøgte virkningerne af vanadiumsulfat (VOSO4) behandling med 5 og 10 mg/kg i 30 dage på endokrin pancreasaktivitet og histologi hos ikke-diabetiske og STZ-inducerede diabetiske rotter. I den diabetiske gruppe steg blodglukoseniveauet signifikant, mens insulinæminiveauet faldt markant. Ved behandlingens afslutning normaliserede VOSO4 i en dosis på 10 mg/Kg blodglukoseniveauet i den diabetiske gruppe, genoprettede insulinæmien og forbedrede insulinfølsomheden betydeligt. VOSO4 øgede også på en dosisafhængig måde antallet af insulinimmunopositive betaceller i bugspytkirteløer hos ikke-diabetiske rotter. I den STZ-diabetiske gruppe blev faldet i antallet af insulinimmunopositive betaceller desuden korrigeret for at nå kontrolniveauet primært med den højere vanadiumdosis. Derfor normaliserede VOSO4-behandling plasmaglukose- og insulinniveauerne og forbedrede insulinfølsomheden i STZ-eksperimentel diabetes og inducerede betacelleproliferation og/eller regeneration hos normale eller diabetiske rotter.

1. Indledning

Vanadium er et overgangsmetal. Det anslås, at der hvert år udledes mere end 60 tusinde tons af dette grundstof i atmosfæren som følge af menneskelige aktiviteter, hovedsagelig fra forbrænding af fossile brændstoffer.

Efter at være kommet ind i kredsløbssystemet via mave-tarm- eller luftvejene transporteres vanadiumforbindelser af transferrin eller, mindre almindeligt, af albumin eller lavmolekylære komponenter i plasma, såsom citrater og i mindre grad laktater eller fosfater . Der er gennemført mange undersøgelser af uorganiske og organiske vanadiumderivater i dyremodeller med induceret diabetes, hvor de undersøgte forbindelser viste sig at påvirke niveauet af glukose, kolesterol og triglycerider uden væsentlige skadelige bivirkninger ved langvarig indgift . Der blev også udført mange forsøg på diabetespatienter, som bekræftede den terapeutiske virkning af vanadiumforbindelser på blodglukoseniveauet med ringe toksiske virkninger .

Vanadium (herunder vanadyl og vanadat) er blevet vist at reducere blodglukoseniveauet ved at stimulere glykogenese, glukoseoptagelse og metabolisme og ved at hæmme glukosedannelse via hepatisk glukoneogenese og glykogenolyse . Det er blevet konstateret, at vanadium og vanadiumforbindelser udviser en insulinlignende aktivitet ved at efterligne insulinvirkninger via insulinreceptortyrosinkinaseaktivering og kinasefosforyleringskaskadeveje . Derfor er vanadylsulfat blevet foreslået som et terapeutisk middel til behandling af type 1-diabetes . Streptozotocin (STZ)-behandling ødelægger de beta-insulinproducerende celler i bugspytkirtlen, og STZ-inducerede diabetiske rotter betragtes som en model for type 1-diabetes mellitus . Selv om vanadiumforbindelser har vist sig at have antidiabetiske egenskaber i STZ-induceret diabetisk model, er mekanismen bag deres virkning stadig under udforskning. Formålet med denne undersøgelse var at undersøge reaktionerne på 30 dages behandling med vanadiumsulfat i ikke-diabetiske og STZ-inducerede diabetiske rotter.

2. Materialer og metoder

2.1. Forberedelse af diabetiske rotter

Dyrene blev gjort diabetiske ved en intraperitoneal injektion (ip) af STZ i en enkelt dosis på 65 mg/Kg i 0,01 M citratbuffer (pH 4,5). Denne ip-metode blev valgt på baggrund af nyere rapporter, der påviste en udtalt glukoseforøgende effekt hos STZ-diabetiske rotter .

2.2. Dyr og behandling

Han Wistar-rotter, 5-6 uger gamle (vægt 175-200 g), blev indkøbt fra Pasteur Institute of Tunisia og anvendt i overensstemmelse med den lokale etiske komité ved universitetet i Tunis for anvendelse og pleje af dyr i overensstemmelse med NIH’s anbefalinger. De fik foder (standardpellet foder-Badr Utique-TN) og vand ad libitum og blev anbragt fem pr. bur ved indsamlet temperatur (22 °C) med en 12-timers lys/mørke-cyklus. Rotterne blev inddelt i seks grupper.

Gruppe 1 var ikke-diabetiske kontroldyr (ND-kontrol) og fik dagligt en intraperitoneal injektion (ip) af NaCl 9. Gruppe 2 og 3 var ND og fik dagligt en dosis på enten 5 eller 10 mg VOSO4/Kg (henholdsvis ND + 5 mg/Kg og ND + 10 mg/Kg) i 30 dage. Gruppe 4 var en diabetisk kontrolgruppe (D-kontrol), der fik en enkelt dosis på 65 mg/Kg STZ injiceret. Gruppe 5 og 6 bestod af STZ-diabetiske dyr, der blev behandlet med enten 5 eller 10 mg/Kg VOSO4 i henholdsvis 30 dage (D + 5 mg/Kg, D + 10 mg/Kg). STZ-grupperne blev behandlet med VOSO4 efter 48 timer med STZ-induceret diabetes.

2.3. Biokemiske analyser

Alle dyr blev fastet 12 timer før bestemmelse af glykæmi ved hjælp af et glukometer (ACCU-CHEK-Active Roche). Insulinfølsomheden blev målt efter ip-injektion af 1 U/Kg insulin, og blodglukoseniveauet blev bestemt med 30 minutters mellemrum i løbet af 2 timer som procent af hormonniveauet ved .

Dyrene blev ofret efter 24 timer efter den sidste behandling, og blodet blev opsamlet, og serumet blev behandlet til estimering af insulin, som blev bestemt ved hjælp af Elisa-kit (distribueret af BioVendor).

2.4. Immunohistokemisk evaluering

Immunohistokemisk farvning af insulin blev udført for at karakterisere integriteten af betaceller i Langerhans-øerne. Til dette formål blev vævsafsnit, der viste den maksimale større overflade af Langerhans-øer, udvalgt til sammenligning mellem grupperne. Sektionerne blev først afpudset, hydreret gennem en aftagende gradvis ethanolserie, nedsænket i tamponcitrat (pH 6) i 40 minutter og derefter inkuberet med et polyklonalt antiinsulin-antiinsulin-antistof fra marsvin fortyndet i 50 mM Tris-HCl, pH 7,6 (DAKO). Efter vask blev snittene inkuberet med fosfatase-konjugeret anti-guinea-svin-antistof, og opvækstproceduren blev assisteret af en TechMate 500-maskine. Endelig blev snittene farvet med hæmatoxylin/eosin.

Ten pancreasøer pr. rotte blev undersøgt under mikroskopet, og antallet af insulinpositive og insulinnegative celler blev talt ved at nummerere deres kerner. Data er udtrykt som procent af insulin-immunopositive celler/totalt antal celler i hver øl.

2.5. Statistisk analyse

Signifikansen af forskellen mellem forskellige grupper blev vurderet ved envejsanalyse af varians (ANOVA) efterfulgt af Tukey’s multiple sammenligningstest, og værdien blev taget som signifikant på niveau.

3. Resultater

VOSO4-behandlingens virkning på blodglukoseniveauet hos ikke-diabetiske (ND) og diabetiske (D) rotter er vist i figur 1. Der var ingen signifikante ændringer i blodglukoseniveauerne i kontrol-ND-gruppen under behandlingen (figur 1(a)). Behandling af ND-rotter med VOSO4 på 5 eller 10 mg/Kg ændrede ikke blodglukoseniveauerne signifikant i løbet af de første 10 dage. Blodglukoseniveauet faldt imidlertid signifikant ved behandlingens afslutning med dosis på 5 mg/Kg og blev signifikant reduceret fra 15 til 30 dage med dosis på 10 mg/Kg sammenlignet med kontrol-ND-gruppen. På dag 30 var faldet i glykæmi ca. 8 og 15 % for henholdsvis doserne 5 og 10 mg/Kg sammenlignet med kontrolgruppen. Som mistænkt blev der observeret en bemærkelsesværdig stigning i blodglukoseniveauet hos de STZ-behandlede kontrolrotter sammenlignet med de ubehandlede dyr ( versus mg/dL), hvilket indikerer en diabetesinstallation, der blev opretholdt under hele forsøget. Behandling af diabetikergruppen (D) med 5 mg/Kg VOSO4 reducerede blodglukoseniveauet betydeligt fra dag 10, mens en dosis på 10 mg/Kg sænkede blodglukoseniveauet betydeligt og gradvist fra dag 5 for at nå et normalt niveau på dag 30. De noterede værdier for glykæmi efter 30 dage var og versus mg/dL i henholdsvis D + 5, D + 10 og kontrol D-grupperne (figur 1(b)).

Tabel 1 viste insulinniveauerne i ND- og D-grupperne uden og efter VOSO4-behandling. ND-rotterne, der blev behandlet med 5 mg/Kg VOSO4, viste ikke signifikante ændringer i insulinniveauet, men der blev opnået en markant stigning med 10 mg/Kg sammenlignet med kontrol-ND-gruppen ( versus µg/L). I kontrol D-gruppen var insulinæmien desuden dybt nedsat i forhold til kontrol ND-dyrene ( versus µg/L). Indgift af VOSO4 i D-grupperne øgede insulinæmien markant på en dosisafhængig måde. Faktisk blev insulinniveauerne øget i diabetiske rotter fra til og µg/L med henholdsvis 5 mg og 10 mg/Kg doser.

Insulinfølsomhedsændringer efter ip-injektion af insulin (1 U/Kg) i normale og diabetisk behandlede dyr er vist i figur 2. Hos ND-rotter ændrede behandling med 10 eller 5 mg VOSO4 ikke glykæmiprofilen som reaktion på insulinadministration (figur 2(a)). I disse grupper blev den maksimale hypoglykæmiske virkning af insulin faktisk observeret efter henholdsvis 60 og 90 minutter og var omkring den oprindelige glykæmiværdi. Diabetiske dyr, der blev behandlet med den lave dosis VOSO4, viste en lignende glykæmiprofil som kontrolgruppen D med et maksimalt fald ved 60 min, mens de dyr, der blev behandlet med den høje dosis, udviste et signifikant () og hurtigt maksimalt fald i glykæmien ved 30 min efter insulininjektion (figur 2(b)).

I VOSO4-behandlingsgrupperne blev det observeret, at størrelsen af bugspytkirteløer var større sammenlignet med deres respektive kontrolgrupper ND og D (figur 3 og 4). Statistiske analyser viste, at VOSO4-behandlinger inducerede en markant stigning i antallet af insulinimmunopositive celler med ca. 20 % i ND + 5 og 27 % i ND + 10 mg/Kg-grupperne (figur 5). VOSO4-behandling øgede signifikant antallet af insulinimmunopositive celler i STZ-diabetikergrupperne på en dosisafhængig måde med henholdsvis 12 og 23 % med 5 og 10 mg/Kg doser (figur 5). Sammenligning mellem STZ-diabetiske behandlede grupper og ND-kontrolrotter viste ingen signifikante forskelle.

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

4. Diskussion

Vi undersøgte de antidiabetiske egenskaber af vanadium ved at udforske dets virkninger på blodglukose- og insulinniveauer samt B-celler i endokrine pancreas.

Ved anvendelse af STZ-inducerede diabetiske rotter viste vi, at behandling med vanadylsulfat (VOSO4) på 5 og 10 mg/Kg signifikant reducerede de gennemsnitlige blodglukoseniveauer ved henholdsvis 10. og 5. dag i forhold til den ubehandlede kontrolgruppe. På dag 30 udviste diabetiske rotter, der fik den højere dosis af stoffet, et lignende glykæminiveau som ND-kontroldyr. Hos ND-rotter ændrede behandlingen med den lavere dosis VOSO4 imidlertid ikke blodglukoseniveauet væsentligt, mens den højere dosis medførte et lille og gradvist fald på 15. behandlingsdag, og glykæmien var faldet med ca. 14 % på 30. dagen. Vores resultater er i overensstemmelse med tidligere data, der viser, at oral indgivelse af vanadiumforbindelser til STZ-inducerede eller genetisk nedarvede eller ernæringsbetingede diabetiske dyr forbedrede hyperglykæmien betydeligt . Hos mennesker rapporterede Soveid et al. om sikkerheden og effektiviteten af oral vanadylsulfatbehandling i en 30-måneders periode hos type 1-diabetiske patienter ved at mindske insulinbehovet og blodglukoseniveauet.

Vores undersøgelse viste også, at den hypoglykæmiske virkning af VOSO4 blev ledsaget af en markant stigning i basal insulinæmi niveau i diabetikergruppen på en dosisafhængig måde. Med en dosis på 10 mg blev insulinæminiveauet hos diabetiske rotter næsten normaliseret. Det fald i blodglukoseniveauet, der blev registreret især hos diabetiske rotter, der blev udsat for vanadiumforbindelse, kan faktisk være relateret til den samtidige stigning i plasmainsulinkoncentrationerne. Disse resultater var i overensstemmelse med tidligere data vedrørende effektiviteten af vanadiumforbindelser til forbedring af diabetisk tilstand .

Vi har endvidere undersøgt virkningen af vanadiumadministration på insulinfølsomheden hos diabetiske og ikke-diabetiske rotter. I ND-grupperne viste vi en maksimal hypoglykæmisk effekt af insulin 60-90 min efter hormonindførelsen. I D-grupper forbedrede VOSO4-behandling med en dosis på 10 mg imidlertid insulinfølsomheden med et hurtigere og mere udtalt fald i blodglukose efter hormoninjektion, mens dosis på 5 mg ikke ændrede glykæmisvaret hos D-rotterne væsentligt. Den forbedrede insulinfølsomhed induceret af VOSO4 er i overensstemmelse med talrige undersøgelser, der indikerer, at vanadium kan betragtes som et potent insulinmimetikum eller insulintrofisk i forskellige væv .

Det er blevet vist, at vanadiumforbindelser er karakteriseret ved flere virkningsmåder, der resulterer i blodsukkersænkning . In vivo og in vitro-undersøgelser rapporterede, at vanadylsulfat øgede glukosetransport og metabolisme i skeletmuskler, lever og fedtvæv . Takket være deres strukturelle lighed med orthofosfat-anioner hæmmer de organiske vanadiumderivater proteinphosphotyrosinphosphatase . De hæmmer også aktiviteten af PTP-1B, et enzym, der er ansvarlig for dephosphorylering af insulinreceptoren, hvilket forårsager insulinresistens . En anden mekanisme til reduktion af blodglukoseniveauet ved hjælp af vanadiumforbindelser er aktivering af PKB/Akt-kinase, hvilket fører til en stigning i glukoseoptagelsen via GLUT4-transporteren . Aktivering af PKB/Akt stimulerer også fosforylering af GSK3, hvilket resulterer i stimulering af glykogensyntesen . På den anden side blev det konstateret, at inhibering af C-jun N-terminal kinase forbedrer insulinfølsomheden ved eksperimentel diabetes .

Vanadium øger glukosetransport og oxidation og insulin-receptor tyrosin-kinaseaktivitet og udøver insulinlignende virkninger på glukose- og lipidmetabolismen ved insulinafhængige eller insulinuafhængige biokemiske veje .

Det er velkendt, at STZ-behandling ødelægger betacellerne i bugspytkirteløerne og fremkalder insulinafhængig diabetes mellitus . I den foreliggende undersøgelse viste vi således en reduktion i arealet af bugspytkirteløer i forbindelse med et markant fald i antallet af immunreaktive betaceller for insulin i den diabetiske gruppe sammenlignet med ikke-diabetiske kontroldyr. I både ND- og D-grupperne forstørrede VOSO4-behandlingen imidlertid størrelsen af bugspytkirteløerne i forhold til de respektive kontrolgrupper. Vigtigst er det, at VOSO4-behandling af diabetiske rotter på en dosisafhængig måde øgede antallet af insulinimmunopositive betaceller i forhold til den ubehandlede diabetiske gruppe, hvilket tyder på, at VOSO4 kan generere betaceller i STZ-inducerede diabetiske rotter. Faktisk var antallet af betaceller i øer hos diabetiske VOSO4-behandlede rotter med 5 og 10 mg ikke signifikant forskelligt fra antallet af betaceller i ND-gruppen. Dette er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser vedrørende denne forbindelses insulinotrope egenskab for pancreas . Interessant nok øgede vanadiumbehandling også signifikant antallet af betaceller i øer fra ikke-diabetiske rotter.

I en musemodel af alloxan-perfunderet pancreas-segment rapporterede Waguri et al. om processer med regenerering af betaceller fra ekstra-islet-prækursorceller. I STZ-diabetiske rotter kunne VOSO4-behandling faktisk stimulere beta-celleproliferation fra intraislet-endokrine celler og differentiering fra ekstra-islet-prækursorceller.

Sammenfattende viser den foreliggende undersøgelse, at vanadylsulfat kan være nyttigt som et potentielt antidiabetisk middel. Da de nuværende beviser imidlertid stadig er begrænsede og hovedsagelig baseret på dyremodeller, og da der kun vides lidt om de terapeutiske formuleringer og bivirkningerne af vanadiumforbindelser, er der behov for yderligere undersøgelser af deres langtidsbrug som konventionel terapi til diabetiske patienter.

Interessekonflikter

Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikter i forbindelse med offentliggørelsen af denne artikel.

Akkreditering

Dette arbejde blev støttet af det tunesiske ministerium for videregående uddannelse og videnskabelig forskning.