Keskustelu

Tässä tutkimuksessa osoitimme, että MR ja GR ovat läsnä rotan lisämunuaiskuoressa. Osoitimme, että MR-aktiivisuuden muuttaminen säätelee aldosteronin tuotantoa ZG:ssä tavalla, joka sopii negatiiviseen palautemekanismiin. Tämä vaikutus on spesifinen MR:lle, sillä GR:n aktiivisuuden moduloinnilla ZG:ssä ei ollut vaikutusta aldosteronin tuotantoon. Tietojemme mukaan tämä on ensimmäinen kerta, kun MR:n ilmentyminen ja sen rooli aldosteronin erityksen säätelyssä lisämunuaisen kuoressa on raportoitu. ZF/ZR:ssä havaitsimme samanlaisen palautesilmukan, kun farmakologisesti muutimme GR:n aktiivisuutta. Mielenkiintoista on, että MR-aktivointi tukahdutti myös kortikosteronin eritystä ZF/ZR-soluissa. Tuloksemme ovat sopusoinnussa aiempien tutkimusten kanssa, jotka osoittavat, että lisämunuaisen glukokortikoidisynteesiä voidaan moduloida lisämunuaiskuoren sisällä syntetisoituvilla steroideilla (Baird ym. 1983, Carsia & Malamed 1983, Darbeida & Durand 1987).

MR:n aktivointi FLUDROlla vaikutti negatiivisesti aldosteronin tuotantoon ZG-soluissa, jotka oli valmistettu sekä HS- että LS-ruokavaliolla ylläpidetyistä rotista, kun taas kanrenoiinihappo, MR:n antagonisti, sääteli positiivisesti steroidogeneesiä lisäämällä aldosteronin eritystä LS-ruokitusta saaneiden rottien ZG-soluissa. Vaste oli selvempi LS-ryhmissä kuin HS-ryhmissä. Se, että GR-agonistilla ja -antagonistilla ei ollut vaikutusta ZG-solujen basaaliseen ja stimuloituun aldosteronin vapautumiseen, viittaa vahvasti siihen, että säätelypalautesilmukka on reseptorispesifinen.

Mitä fysiologista ja kliinistä merkitystä aldosteronin ultralyhyellä palautesilmukalla voisi olla? Aldosteronin tuotannon ja ympäristötekijöiden, kuten natriumin ja kaliumin saannin, asennon, vuorokaudenajan ja tilavuushäviön, välillä on tiukka yhteys. On jo pitkään todettu, että näiden ympäristötekijöiden tasoon nähden sopimaton aldosteronitaso johtaa erilaisiin sydän- ja verisuonitauteihin ja aineenvaihduntasairauksiin ihmisillä ja muilla eläimillä. Siksi kriittisesti herkät negatiiviset palautesilmukat ovat tärkeitä normaalin homeostaasin ylläpitämiseksi. Tämä on erityisen tärkeää tilavuuden/natriumin homeostaasin kannalta, sillä jopa vähäisetkin vääränlaiset vasteet ympäristön natriumin saannin muutoksiin ajan mittaan voivat johtaa huomattaviin haitallisiin sydän- ja verisuonivaikutuksiin. Nämä mahdolliset seuraukset ovat todennäköisesti syynä siihen, että tilavuutta/natriumhomeostaasia säätelevissä järjestelmissä, kuten reniini-angiotensiinijärjestelmässä, aldosteronissa, natriureettisissa peptideissä, endoteliinissä, vasopressiinissa ja munuaisissa (munuaisten verenkierto, proksimaalinen tubulus, Henlen silmukka ja distaalinen tubulus/keräyskanava), on useita tarkastuksia ja tasapainoja. Näitä säätelytekijöitä säätelevät osittain: (1) ”pitkät” negatiiviset takaisinkytkennät, esim. tilavuus-reniiniangiotensiini-aldosteroni-negatiivinen takaisinkytkentä; (2) vastakkaisesti vaikuttavien tekijöiden vaikutussuunta, esim. natriureettiset peptidit, jotka tukahduttavat aldosteronin eritystä, ja (3) ultralyhyet takaisinkytkennät, esim. reniinin vapautumisen suora tukahduttaminen juxtaglomerulaarisesta laitteistosta angiotensiini II:n vuorovaikutuksen avulla angiotensiinin reseptori-tyyppi 1:n kanssa. Eräissä suhteissa ultralyhyiden takaisinkytkentäsilmukoiden toiminnot ovat analogisia lähes universaalin käsitteen kanssa, joka koskee entsyymin toiminnan estämistä tuotteella. Angiotensiini II:n vaikutuksen rinnalla nykyinen tutkimus tukee hypoteesia, jonka mukaan on olemassa myös ultralyhyt takaisinkytkentäsilmukka, joka muuttaa aldosteronituotantoa sen loppusynteesipisteessä aldosteronin ja MR:n tason avulla. Tämä vaihe tarkentaa edelleen aldosteronin tuotantoa varmistaakseen, että se on sopiva siihen ympäristöön, jossa organismi tällä hetkellä asuu. Tietenkin se tarjoaa myös toisen pisteen näissä tilavuushomeostaattisissa mekanismeissa, joissa toimintahäiriö voi johtaa sydän- ja verisuonitautien toimintahäiriöihin ja sairauksiin. Kaksi raporttia on mahdollisesti merkityksellisiä näiden mahdollisuuksien kannalta. Toisin kuin näissä normaaleilla ZG-soluilla tehdyissä tutkimuksissa, joissa RU 486:lla ei ollut vaikutusta aldosteronin eritykseen, kahdessa muuttuneessa tilassa, primaarisissa aldosteronikasvainsoluissa (Burton ym. 2011) ja Zuckerin liikalihavilla hypertensiivisillä rotilla (Clapham & Turner 1997), RU 486 tukahdutti plasman aldosteronipitoisuutta mutta ei plasman kortikosteronitasoja. Tämän tutkimuksen tavoin RU 486 ei muuttanut aldosteronitasoja kontrollirotilla (Clapham & Turner 1997). Mielenkiintoista on, että kasvainsoluissa MR-antagonisteilla ei ollut vaikutusta aldosteronin tuotantoon. MR:n aktivointia ei suoritettu. Koska soluvalmisteissa havaittiin samanlaisia aldosteroni- ja kortisolitasoja, kyseessä oli solujen sekoittuminen tai muuttunut solutyyppi (Burton ym. 2011). Lopuksi tämän tutkimuksen tuloksia voidaan soveltaa steroidien säätelyyn lisämunuaisen ulkopuolella, ja niillä on todennäköisesti fysiologista ja kliinistä merkitystä.

Miten muutokset MR-aktiivisuudessa muuttavat aldosteronin eritystä? Kortikosteronin erityksen lisääntyminen ja samanaikainen aldosteronin tuotannon suppressio viittaavat siihen, että aldosteronin biosynteesin myöhäinen reitti on säätelykohde. Aldosteronin synteesin viimeinen vaihe perustuu CYP11B2:n (aldosteronisyntaasi) aktiivisuuteen (Mornet ym. 1989). Kortikosteronin muuntumisen väheneminen aldosteroniksi johtuu todennäköisesti CYP11B2:n vähentyneestä aktiivisuudesta eikä CYP11B2:n ilmentymisen muutoksesta, koska kokeemme kesto oli lyhyt (1 h). Havaintomme CYP11B2-proteiinipitoisuuden vähenemisestä HS-olosuhteissa ja ehdotettu mekanismi, jolla MR muuttaa CYP11B2:n aktiivisuutta, selittää todennäköisesti säätelypalautesilmukan heikentymisen runsassuolaisessa ruokavaliossa.

Matalan natriumin saanti on tunnettu aldosteronin erityksen stimuloija (Marusic & Mulrow 1967, Aguilera & Catt 1979), ja tuloksemme ovat linjassa näiden raporttien kanssa. Havaitsimme seerumin kortikosteronin kohoamista runsaasti suolaa sisältävän ruokavalion yhteydessä. Seerumin kortikosteronin nousun kanssa johdonmukaisesti korkeaa suolapitoista ruokavaliota saaneista rotista eristetyt ZF/ZR-solut osoittivat korkeampaa kortikosteronin peruseritystä. Mekanismeja, joilla ruokavalion natrium vaikuttaa kortikosteronin eritykseen, ei ole tutkittu, vaikka aiemmat tutkimukset ovatkin osoittaneet, että natriumin puutteessa olevien rottien lisämunuaisten kortikosteronin eritys on vähentynyt (Eisenstein & Strack 1961). Kortikosteronia voidaan tuottaa sekä ZF/ZR:ssä että ZG:ssä, mutta suurin osa kiertävästä kortikosteronista on peräisin ZF/ZR:stä, koska niiden massa on huomattavasti suurempi. Koska ruokavalion natriumin saannin muutokset eivät kuitenkaan vaikuttaneet kortikosteronin vapautumiseen ZG-soluista, päättelimme, että ZF/ZR-solut vaikuttivat osaltaan seerumin kortikosteronin nousuun suuren natriumin saannin yhteydessä.

Useat in vivo (Peron ym. 1960, Hill & Singer 1968, Hill & Singer 1968) ja in vitro -tutkimukset (Morrow ym. 1967, Carsia & Malamed 1983, Morrow ym. 1967, Carsia & Malamed 1983) ovat jo pitkään ehdottaneet lisämunuaisen sisäisen takaisinkytkentäkierukan olemassaoloa, jota glukokortikoidit ja GR vaikuttavat glukokortikoidituotannon säätelyyn. Näissä tutkimuksissa raportoidaan vastakkaisia tuloksia siitä, estävätkö vai stimuloivatko glukokortikoidit glukokortikoidituotantoa. Säätelyn suunta näyttää riippuvan käytetystä koemallista ja hoidon kestosta. Tässä tutkimuksessa tarjoamme todisteita kortikosteronin erityksen negatiivisesta säätelypalautteesta, joka on yhdenmukainen Carsia & Malamedin (1983) havaintojen kanssa, vaikka muut tutkijat ovat raportoineet päinvastaisista havainnoista (Darbeida & Durand 1987, Li et ai. 2011, Asser et ai. 2014). Laajasta työmäärästä huolimatta mekanismeja, joilla glukokortikoidit säätelevät steroidogeneesiä, ei tunneta hyvin. Tuloksemme, jotka osoittavat kortikosteronin erityksen merkittävää vähenemistä vain ACTH-stimuloitujen ZF/ZR-solujen kortikosteronin erityksessä DEX-hoidolla, ovat sopusoinnussa Latnerin ja työtovereiden havaintojen kanssa (Latner ym. 1977), jotka viittaavat siihen, että glukokortikoidit vähentävät ACTH:n sitoutumista reseptoriinsa. Lisäksi glukokortikoidiantagonisti RU 486 ei vaikuttanut kortikosteronin peruseritykseen, mutta stimuloi kortikosteronin tuotantoa ACTH:lla. Nämä tiedot viittaavat siihen, että GR-aktiivisuus muuttaa ZF/ZR-solujen herkkyyttä ACTH:lle. Muut pidempiä inkubaatioaikoja käyttävät työt viittaavat siihen, että glukokortikoidit estävät proteiinisynteesiä ja säätelevät transkriptiota useilla kohdegeeneillä lisämunuaiskuoressa (Morrow ym. 1967, Asser ym. 2014). Vaikka tämä selitys vaikuttaa epätodennäköiseltä tutkimuksessamme kokeidemme keston vuoksi, emme voi sulkea pois sitä mahdollisuutta, että genomivaikutukset ovat saattaneet vaikuttaa havaintoihimme.

Yllättävä havainto tutkimuksessamme oli, että ZF/ZR toisin kuin ZG ei osoita reseptorispesifisyyttä. GR:n tai MR:n aktivointi voi tukahduttaa kortikosteronin tuotannon ZF/ZR:ssä. MR-aktivoinnin on raportoitu moduloivan glukokortikoidituotantoa, mutta tämä vaikutus on osoitettu vain aivoissa. Fludrokortisonin antamisen ihmisille havaittiin estävän kortisolipitoisuuksia hypotalamus-aivolisäke-akselin (HPA) alasäätelyllä (Otte ym. 2003, Buckley ym. 2007, Lembke ym. 2013). MR:n selkeä vaikutus glukokortikoidien HPA-palautesäätelyyn osoitettiin edelleen, kun kanrenoiinihapolla osoitettiin olevan päinvastainen vaikutus kortisolin ja ACTH:n eritykseen (Arvat ym. 2001, Wellhoener ym. 2004). Tuloksemme viittaavat siihen, että sen lisäksi, että MR-aktiivisuus säätelee glukokortikoidituotantoa keskitetysti, se voi säädellä sitä myös paikallisesti lisämunuaisessa, vaikka säätely riippuu ilmeisesti suolan saannin tasosta. Molemmilla ruokavalioilla vasteena ACTH:lle MR-aktivaatio estää kortikosteronin tuotantoa, mutta epäselvistä syistä vähäsuolaisella ruokavaliolla se näyttää lisäävän kortikosteronitasoja. Ottaen huomioon, että in vivo lisämunuaisen verenkierto on ZG:stä ZF/ZR:ään, aldosteronilla voi olla parakriininen vaikutus glukokortikoidituotantoon, millä on mielenkiintoisia fysiologisia ja patofysiologisia seurauksia.

Tutkimuksen yksi rajoitus oli se, että glomerulosa- ja fasciculata-vyöhykkeiden välinen kontaminaatio saattoi mahdollisesti peittää alleen muutokset vasteena erilaisiin ärsykkeisiin. Mielestämme tämä on epätodennäköistä perustuen CYP11B2: n puuttumiseen ZF / ZR: ssä ja mikroskooppisiin tietoihin, joissa ZF / ZR- ja ZG-soluilla on selvästi erilaiset ominaisuudet, osoitti vain vähän, jos lainkaan, kontaminaatiota kahdessa solunäytteessä. Toinen rajoitus on se, että tässä tutkimuksessa ei voida arvioida näiden parakriinisten ja klassisten endokriinisten, lisämunuaisen steroidogeneesiä ohjaavien vaikutusten suhteellista merkitystä. Kolmas rajoitus on, että emme tiedä, voiko kortisolilla tai kortikosteronilla vuorovaikutuksessa MR:n kanssa olla sama vaikutus kuin aldosteronilla. Kuitenkin, kuten aiemmin mainittiin, kun otetaan huomioon verenkierron suunta glomerulosa-vyöhykkeiltä fasciculata-vyöhykkeille, jos se tapahtuisi, se ei olisi paikallinen, parakriininen vaikutus. Neljänneksi emme voi sulkea pois MR-agonistin ja -antagonistin ristireaktiivisuutta GR:n kanssa. Vaikka fludrokortisonilla tiedetään olevan jonkin verran glukokortikoidivaikutusta, sen affiniteetti MR:ään on 15-kertainen GR:ään verrattuna (Agarwal ym. 1977). Tiedossamme ei ole raportteja kanreenihapon ja GR:n vuorovaikutuksesta millään annoksella. Viidenneksi, kun emme havainneet manipulaation vaikutusta perussteroidituotantoon, emme voi varmuudella päätellä, että sitä ei ole, sillä yhtä todennäköinen tulkinta olisi, että määritysjärjestelmämme eivät ole riittävän herkkiä havaitsemaan pieniä vaikutuksia. Lopuksi näiden rottatutkimusten ekstrapolointi ihmisiin on epävarmaa.

Johtopäätöksenä voidaan todeta, että lisämunuaisen steroidituotantoa säätelevien klassisten pitkien takaisinkytkentäsilmukoiden lisäksi tämä tutkimus tukee hypoteesia, jonka mukaan on olemassa negatiivisia ultralyhyitä säätelysilmukoita, joita välittävät nimenomaan MR aldosteronin eritykselle ja GR kortikosteronin tuotannolle eristetyissä ZG:n ja ZF:n ja ZR:n soluissa. Raportoimme tässä odottamattoman havainnon, että MR-aktivaatio säätelee negatiivisesti myös glukokortikoidien eritystä ZF/ZR-soluissa. On epävarmaa, miten nämä lyhyet palautesilmukat ovat vuorovaikutuksessa niiden pitkien palautesilmukoiden kanssa. Nämä havainnot herättävät kuitenkin kiehtovia kysymyksiä näiden steroidien tuotannon fysiologisesta säätelystä ja mahdollisesta patofysiologisesta säätelyhäiriöstä.