3.53.4.3 Synteettinen faagiterapia

Bakteriofageilla tai yksinkertaisesti faageilla on ollut keskeinen rooli molekyylibiologian ja bakteerien genetiikan kehityksessä, ja ne ovat tarjonneet ensimmäiset työkalut DNA-molekyylien rekombinointiin, kuten restriktioentsyymit ja ligaasit. Viime vuosikymmenellä faagien resistenssimekanismien tutkiminen on johtanut yhden tärkeimmistä SB:n mahdollistavista teknologioista PCR:n jälkeen: CRISPR-nukleaasijärjestelmät, jotka bakteerit ja arkeologiset eläimet ovat kehittäneet adaptiivisena puolustautumiskeinona eksogeenista DNA:ta vastaan. Äskettäin tunnistetut lukuisat muut aiemmin luonnostelemattomat fageja vastustavat systeemit saattavat tarjota uusia läpimurtotekniikoita SB-sovelluksia varten.45 Tässä historiallisessa kontekstissa on sopivaa, että SB:tä sovelletaan nyt faageihin, jotta niiden käyttöä terapeuttisina aineina voitaisiin parantaa.

Faagit löysivät Frederik Twort ja Félix D’Hérelle toisistaan riippumatta 1900-luvun alkupuoliskolla46,47 , ja pian sen jälkeen niitä etsittiin mikrobilääkeaineiksi, joilla voitiin hoitaa tarttuvia tauteja, kuten koleraa ja ruttoa. Itä-Euroopassa faagihoito yleistyi, ja useita tunnettuja hoitokeskuksia on nykyäänkin olemassa esimerkiksi Georgiassa ja Puolassa. Länsimaissa faagihoito hiipui joidenkin satunnaisten alkuonnistumisten jälkeen käytöstä, kun antibiootteja tuli laajalti saataville. Nykyään mikrobilääkkeille vastustuskykyisten taudinaiheuttajien, aluksi niin sanottujen ESKAPE-kantojen48 , mutta nykyisin vielä laajemman joukon taudinaiheuttajien49 , joiden ennustetaan aiheuttavan vuoteen 2050 mennessä enemmän kuolemantapauksia kuin syövän, yleistymisen myötä kiinnostus faagihoitoa kohtaan on herännyt uudelleen.

Faagien käytöllä on useita etuja antibiootteihin verrattuna, ennen kaikkea mahdollisuus kohdistaa hoito tiettyihin kantoihin ja siten jättää hyödyllinen mikrobiyhteisö koskemattomaksi, ja myös kyky voittaa resistenssi käyttämällä täydentäviä faagikoktaileja, ”kouluttamalla” faageja valituissa isäntäkannoissa tai yksinkertaisesti eristämällä uusia faageja patogeenia vastaan. Jotta faagihoidosta tulisi luotettava lääke ja se otettaisiin laajalti käyttöön länsimaissa, on kuitenkin vielä useita esteitä voitettava ja parannettavaa. Tällaisia esteitä ovat esimerkiksi vahvat kliiniset tutkimukset, joissa on asianmukaiset kontrollit, sopivan isäntävalikoiman omaavien faagien tunnistamiseen kuluvan ajan lyhentäminen, faagiresistenssin ja kohdekannan poissulkemismekanismien voittaminen ilman monimutkaisia koktaileja, faagipartikkeleihin kohdistuvien ei-toivottujen immuunivasteiden kiertäminen ja antibioottiresistenssigeenien tai bakteerien virulenssitekijöiden yleistyneen siirron hillitseminen. Jopa siinä tapauksessa, että kohdekannan tappaminen onnistuu, suuren bakteerimäärän nopea lyysi ja samanaikainen endotoksiinien ja superantigeenien vapautuminen voivat johtaa voimakkaaseen tulehdusreaktioon ja epäsuotuisaan kliiniseen lopputulokseen.

Faagien genomien erittäin modulaarinen organisoituminen ja faagirakenteen kokoaminen funktionaalisiksi moduuleiksi, kuten häntäkuiduiksi, piikeiksi, hännänvarsiputkiksi ja kapsidiksi, tekeekin faageista ihanteellisia kohteita SB-lähestymistapoja ajatellen, ja tavallaan faagien genomit ovat jo järjestäytyneet BioBrickeiksi. Tulevaisuuden synteettisen faagisuunnittelun varhaisvaiheessa filamenttista faagia Pf3 muokattiin hoitamaan Pseudomonas aeruginosa -infektiota hiirimallissa50 . Pf3:n vientiproteiinigeeni korvattiin BglII- restriktioendonukleaasia koodaavalla geenillä sillä perusteella, että 1) tämä geenin korvaaminen tekee Pf3:sta ei-replikatiivisen ja ottaa siten käyttöön eristämisstrategian, 2) faagi voi lisääntyä vakaasti isännässä, joka sisältää BglII-metylaasigeenin, ja 3) BglII katalysoisi kaksoissäikeiden katkeamisia kohdekannan genomitason DNA:ssa, jotta se voisi tappaa. Tämän tutkimuksen tärkeä havainto oli, että tartunnan saaneiden hiirten hoito muokatulla Pf3R-faagilla tai lyytisellä faagilla antoi vertailukelpoisen eloonjäämismahdollisuuden hiirille, jotka altistuivat tappavalle minimiannokselle 3, mutta tappavalla minimiannoksella 5 eloonjäämisprosentti oli huomattavasti parempi Pf3R-faagihoidolla. Seerumin sytokiinitasojen analyysi osoitti, että tulehdusreaktio oli vähäisempi, mikä viittaa siihen, että Pf3R-hoitoryhmän parempi lopputulos johtuu kohdekannan tehokkaasta tappamisesta ilman lyysiä ja endotoksiinin vapautumista.

P. aeruginosa -bakteerin tappaminen Pf3R-faagin avulla perustuu faagin isäntävalikoimaan, joka takaa spesifisen kohdentumisen, sillä BglII- restriktiokohtien odotetaan esiintyvän periaatteessa kaikissa bakteerien genomeissa. Parannukseen viittaa merkittävä löydös bakteriofaagista, joka on saanut tuntemattomasta lähteestä CRISPR/Cas-järjestelmän omaan käyttöönsä.51 Faagin koodaama CRISPR/Cas-järjestelmä pystyy hankkimaan uusia välikappaleita, ja CAS3-nukleaasi on kohdistettu uudelleen kromosomaaliseen elementtiin, jota sen isäntä Vibrio cholera käyttää synnynnäisessä immuniteetissa. Tämän löydön jälkeen Streptococcus pyogenes -bakteerista peräisin oleva tyypin II CRISPR-järjestelmä muokattiin M13-bakteriofagiin, jossa on spacereita, jotka kohdistuvat antibioottiresistenssi- ja virulenssigeenien sekvensseihin Escherichia coli -bakteerissa, ja kirjoittajat kutsuvat näitä laitteita RNA-ohjatuiksi nukleaaseiksi (RNA-guided nucleases, RGN:t).52 Järjestelmän hieno spesifisyys osoitti, että RGN:llä pystyttiin tappamaan erittelemättömästi kanta, joka sisälsi DNA-gyrassaa, joka aiheuttaa kinolooniresistenssin, sisältävän yksittäisen nukleotidin polymorfismin. Lisäksi ne pystyivät kolmen bakteerikannan keinotekoisessa konsortiossa tappamaan valikoituja kantoja (400-20 000-kertainen tappo kontrolleihin verrattuna) jättäen muut konsortion jäsenet koskemattomiksi. CRISPR/Cas-välitteisen tappamisen spesifisyys voisi laajentaa faagiterapiaa taudinaiheuttajien torjuntaa laajemmalle ja mahdollistaa ihmisen mikrobiomin täsmällisen muokkaamisen, sillä mikrobiomin koostumuksen on todettu vaikuttavan joidenkin syöpien ja jopa neurologisten sairauksien, kuten autismin, Parkinsonin ja Alzheimerin taudin, ennusteeseen suolisto-aivot-akselin kautta.

Ihanteellinen synteettisen faagin käyttöalusta saattaisi olla sellainen, jossa isännän sitoutuminen on suunniteltu hyvin laajaksi, kun taas CRISPR/Cas-kuormitus antaa mahdollisuuden kohdistua tiettyyn kantaan. Tällä tavoin fageja voitaisiin helposti käyttää hoitoihin ilman, että uutta alustaa tarvitsisi eristää ad hoc kutakin patogeenia varten. Lisäksi laaja isäntävalikoima yhdistettynä useisiin antibioottiresistenssi- tai virulenssigeeneihin kohdistuviin CRISPR-matriiseihin voisi mahdollistaa ennakoivan faagihoidon käytön, toisin sanoen ennen patogeenin tunnistamista. Isäntävalikoiman laajentamisstrategioihin kuuluvat eteenpäin suuntautuvat geneettiset seulonnat faagireseptorien ja tarvittavien isäntätekijöiden tunnistamiseksi,53 profaagien reseptoria sitovien proteiinisekvenssien (RBP-sekvenssien) louhinta bakteerien genomista ja synteettisten faagien uudelleenkäynnistäminen, jotka voisivat esimerkiksi koodata reseptoria sitovia proteiineja RBP-kirjastoja HTS:ää varten54,55. Reseptorien peittäminen kapseleilla voidaan voittaa ilmentämällä eksopolysakkaridia hydrolysoivia entsyymejä56 ja muita biofilmiä hajottavia entsyymejä57 , kun taas muut peittämismekanismit ja reseptorien ilmentymisen vaiheittainen vaihtelu voidaan voittaa faageilla, jotka on muunnettu siten, että niissä on useita eri RBP:itä sisältäviä häntäkuituja tai että niissä on RBP:itä, jotka kohdistuvat ei-kanonisiin, pitkälle konservoituneisiin, erittäin konservoituneisiin solunpinnan kohteisiin. Bakteerit käyttävät lukuisia faagien vastaisia järjestelmiä, joista tärkeimpiä ovat restriktiomodifikaation synnynnäinen immuniteetti ja CRISPR/CAS:n adaptiivinen immuniteetti, mutta päinvastoin faagit ovat kehittäneet useita strategioita näiden järjestelmien päihittämiseksi, kuten käyttämällä DNA:ssaan ei-kanonisia nukleotideja, vähentämällä restriktiokohtien lukumäärää tai hypermetyloimalla genomejaan ja luovuttamalla proteiineja, jotka estävät restriktioentsyymejä tai parantavat isäntäkasvattamon metylointientsyymiä.

Tässä kuvatulla synteettisellä faagialustalla vältettäisiin tarve faagicocktaileihin, joiden viranomaishyväksyntä voi olla monimutkaisempaa. Faagitekniikan jäljellä olevat kohteet ovat yleisiä monille biologisille lääkkeille, kuten vakaus ja immuunijärjestelmän vaste. Erityisesti fagosyyttiset solut ovat vastuussa faagipartikkelien poistamisesta verenkiertojärjestelmästä. Pitkään kiertäviä faagimutaatioita saatiin sarjapassagointitekniikalla58 , ja niissä havaittiin mutaatioita tärkeimmässä kapsidiproteiinissa. Myöhemmin suoralla geneettisellä manipuloinnilla tehty yksittäinen aminohappomuutos, myös kapsidiproteiinissa, johti siihen, että faagin kyky pysyä hiiren verenkiertojärjestelmässä kasvoi 13 000-16 000-kertaiseksi59. Muut parametrit, joiden avulla faageja voidaan parantaa terapeuttisina aineina, kuten tuotanto, formulointi ja antoreitti, eivät luultavasti kuulu SB-toiminnan piiriin, mutta aiemmasta natiivien faagien parissa tehdystä työstä saatuja kokemuksia voidaan soveltaa myös SB:llä kehitettyihin faageihin.

Viime vuosikymmenen aikana faagihoitoa kohtaan heränneen uudenlaisen mielenkiinnon ja yksittäisten onnistuneiden potilastapausten satunnaisten raporttien myötä on yritetty tehdä kontrolloituja kliinisiä kokeita, joiden tuloksena ei ole ollut huomattavia haitallisia sivuvaikutuksia, mutta tehoa ei ole vieläkään pystytty osoittamaan painokkaasti. Yli 100 vuotta sitten alkaneen faagihoitotarinan seuraava jännittävä artikkeli on se, että SB-valmisteiset faagit pääsevät kliinisiin tutkimuksiin.