Genomin sekvensointi ja kokoaminen

Sekvensoimme naaraspuolisen baktriankamelin (79,3-kertainen kattavuus), urospuolisen dromedaarin (65,0-kertainen kattavuus) ja naaraspuolisen alpakan (72,5-kertainen kattavuus) genomit Illumina HiSeq2000-alustaa käyttäen. Nykyinen arvio baktriankamelin genomin koosta (2,45 Gb) on verrattavissa aiempaan raporttiin (2,38 Gb), joka perustuu K-mer-analyysiin3. Kolmen yksilön kootut genomikoot olivat 2,01, 2,01 ja 2,05 Gb (lisätaulukot 1-10 ja lisäkuvat 2 ja 3). Baktriankamelin nykyinen koottu genomin koko on sama kuin aiemmin raportoitu koko3. Kontigin N50 pituus (taulukko 1) oli 24,9 kb ja 8,7 Mb baktriankamelin osalta, 54,1 kb ja 4,1 Mb dromedaarin osalta ja 66,3 kb ja 5,1 Mb alpakan osalta. Verrattuna luonnonvaraisen baktriankamelin3 genomiin näiden kolmen kameliinin nykyisillä genomeilla on lyhyemmät contig N50-pituudet mutta suuremmat scaffold N50-pituudet. Kirjastojen, joiden insertin koko oli 2 kb, kartoitus telineeseen osoitti, että jokainen genomisekvenssi oli korkealaatuinen (täydentävä kuva 4 ja täydentävät menetelmät), ja myös baktriankamelin transkriptomi osoitti, että nykyisen ja luonnonvaraisen baktriankamelin3 genomikokoonpano oli korkealaatuinen (täydentävät taulukot 11 ja 12). Kamelidien genomeissa oli paljon synteniaa ihmisen ja naudan referenssigenomien kanssa (kattavuusaste >83 %), ja genomien uudelleenjärjestäytyminen oli suhteellisen vähäistä kamelieläinten sisällä (lisätaulukot 13 ja 14 sekä täydentävät menetelmät). Tässä tutkimuksessa havaittu syntenia baktriankamelin ja naudan genomien välillä on suurempi kuin aiemmin raportoitu3. Tutkimuksemme tukee käsitystä siitä, että kamelieläinten erilainen evoluutio on tapahtunut yksittäisten geenimutaatioiden tai vähäisten kromosomien uudelleenjärjestelyjen kautta5. Arvioimme näiden kolmen yksilön segmenttiduplikaation: segmenttiduplikaation kokonaispituus sekä baktriankamelilla että dromedaarilla oli 26 Mb, mikä on pienempi kuin alpakalla (36 Mb) (lisätaulukko 15). Näiden kolmen yksilön segmentaalinen duplikaatio on pienempi kuin naudoilla raportoitu duplikaatio (94,4 Mb)6.

GENOMIEN ANNOTOINTI

Käyttämällä homologisten sekvenssihakujen ja ab initio -geeniennusteiden yhdistelmää annotoimme 20 251, 20 714 ja 20 864 geeniä baktriankamelin, dromedaarin ja alpakan genomiin (Täydentävä kuva 5 ja Täydentävät taulukot 16 ja 17). Käytimme CEGMA-menetelmää7 , joka sisältää 458 keskeistä eukaryoottista geeniä, genomien ja annotaation täydellisyyden arviointiin. Valtaosa näistä ydingeeneistä oli linjassa kamelidien genomien kanssa (99,12 % baktriankamelin, 98,47 % dromedaarin ja 99,12 % alpakan osalta), ja suurin osa niistä esiintyi ennustetuissa geenijoukoissa (97,82 % baktriankamelin, 96,73 % dromedaarin ja 93,87 % alpakan osalta), mikä tukee koottujen genomien ja geenijoukkojen identifioinnin täydellisyyttä (Täydentävät taulukot 18-20). Kolmen kamelidi-geenisarjan vertailevat analyysit paljastivat geenisekvenssien suuren samankaltaisuuden (>90 %), mutta erilaiset ei-synonyymiset/synonyymiset (Ka/Ks) jakaumat (täydentävät kuvat 6 ja 7). Geenisarjojen funktionaaliset analyysit osoittivat, että >91 % geeneistä oli funktionaalisesti annotoitu kussakin genomissa (Täydentävät taulukot 21-23).

Kamelidien genomien toistosekvenssipitoisuus (30,4 % baktrian kamelilla, 32.1 % alpakassa ja 28,4 % dromedaarissa) oli 10 % pienempi kuin naudan (42,5 %) ja ihmisen (46,1 %), mikä johtuu lyhyiden lomittuneiden nukleotidielementtien vähäisestä määrästä kamelidien genomissa (Täydentävät taulukot 24-27). Baktriankamelin genomin toistosekvenssipitoisuus oli samankaltainen kuin aiemmin raportoitu3. Koodaamattomien RNA-geenien annotointi paljasti samanlaiset kopioluvut kummassakin genomissa (baktrian kameli=1 942; dromedaari=2 209; alpakka=2 328; lisätaulukot 28-30). Tunnistimme 12 539 homologista geeniperhettä, jotka ovat yhteisiä neljälle lajille järjestyksessä Cetartiodactyla (baktriankameli, dromedaari, alpakka ja nauta): 156, 153 ja 296 geeniperhettä olivat spesifisiä baktriankamelille, 153 dromedaarille ja 296 alpakalle (kuva 1).

Evoluutioanalyysi ja fylogenia

Konstruoitiin fylogeneettinen puu, johon kuuluivat kamelieläimet (baktriankameli, dromedaari ja alpakka) ja seitsemän muuta lajia (nauta, hevonen, koira, panda, ihminen, hiiri ja opossumi). Puu luotiin PhyML8-ohjelmalla TreeFam9-ohjelmalla tunnistetuista 7 398 yhden kopion ortologisesta geenistä poimittujen nelinkertaisten degeneroituneiden koodonipaikkojen perusteella (liitetaulukko 31 ja liitekuvat 8 ja 9). Arvioitu eroamisaika kamelidien ja nautojen välillä on 42,7 miljoonaa vuotta sitten (Mya) (Kuva 2 ja Täydentävä kuva 10). Tämä tulos on yhdenmukainen sen ajan (45,9 Mya) kanssa, jolloin paleontologisten todisteiden mukaan Camelidae-suku ilmestyi ensimmäisen kerran Pohjois-Amerikkaan10 , mutta se on ristiriidassa aikaisemman 332 ortologin perusteella tehdyn arvion kanssa naudan ja baktriankamelin sukulinjojen eroamisajankohdasta (55-60 Mya)3 . Alpakan ja kahden kamelin esi-isien arvioitu eroamisaika (16,3 Mya) on yhdenmukainen paleontologisten löydösten kanssa, mikä osoittaa, että Camelini- ja Lamini-heimojen jakautuminen tapahtui Pohjois-Amerikassa ~17 Mya (viite 10). Baktriankamelin ja dromedaarin välinen eroamisaika on ~4,4 Mya, mikä merkitsee, että ne erosivat toisistaan todennäköisesti sen jälkeen, kun niiden yhteinen esi-isä vaelsi Pohjois-Amerikasta Beringin kannaksen kautta Euraasiaan myöhäismioenin aikana (7,246-4,9 Mya)10,11. Analysoimme haarakohtaiset Ka/Ks-substituutiosuhteet (ω) näiden kymmenen nisäkkään osalta Kosiolin ym. menetelmällä12: baktriankamelin ja dromedaarin haarojen ω-arvot olivat korkeammat (täydentävä kuva 11, täydentävä taulukko 32 ja täydentävät menetelmät). Tämä nopeutunut evoluutio kameleilla nostaa esiin mahdollisuuden kamelikohtaisesta evoluutiosta aavikkoympäristöön sopeutumiseksi.

Heterotsygoottiasteet ja demografinen historia

SNP:t tunnistettiin SOAPsnp13:n avulla. Baktrian kamelin, dromedaarin ja alpakan genomien arvioidut heterotsygoottiasteet olivat vastaavasti 1,16 × 10-3, 0,74 × 10-3 ja 2,66 × 10-3 (lisätaulukot 33-35). Tässä arvioitu baktriankamelin heterotsygoottien osuus on verrattavissa aiemmin raportoituihin (1,0 × 10-3 ja 1,29 × 10-3)3,4. Näiden nisäkkäiden genomiset SNP-jakaumat ovat erilaiset (Täydentävä kuva 12).

Näiden kamelidien demografinen historia rakennettiin SNP-datan perusteella soveltamalla PSMC-mallia (pair-wise sequentially Markovian coalescent, pareittain sekventiaalinen Markovian coalescent, PSMC)14 (kuva 3). Analyysimme tulokset osoittivat, että baktriankamelin esi-isällä oli vakaat populaatiokoot kahden 3,69 ja 2,61 Mya:n aikana tapahtuneen taantuman jälkeen. Dromedaarin esi-isälle laskettiin kaksi populaatiokoon laskua, jotka ajoittuivat 1,72 ja 0,77 mya:n päähän. Nämä molempien lajien esi-isien arvioidut populaatiokoon laskut ovat johdonmukaisia geologisten aikakausien välisten siirtymien kanssa, mukaan luettuina Zanclean ja Piacenzian (3,60 Mya), Piacenzian ja Gelasian (2,59 Mya), Gelasian ja Kalabrian (1,81 Mya) sekä Kalabrian ja Joonian (0,78 Mya)15 , mikä viittaa todennäköiseen korrelaatioon. Lisäksi dromedaarin esi-isäpopulaation laajeneminen tapahtui 1,25 ja 0,77 mya:n välisenä aikana, mikä osuu yksiin keskipleistoseenin siirtymävaiheen kanssa, joka alkoi 1,25 ja päättyi 0,70 mya:n välisenä aikana, jolloin maapallon ilmasto muuttui perustavanlaatuisesti16 , mikä vaikutti merkittävästi eliöstön levinneisyyteen ja evoluutioon17. Tämä aikaväli osuu myös yhteen galerian nisäkkäiden kauden (1,2-0,60 mya) kanssa, jolle oli ominaista eläimistön uudistuminen, joka joissakin tapauksissa synnytti uusia lajeja, jotka olivat sopeutuneet kuiviin ja kylmiin ilmastoihin18; mikä tärkeämpää, tämä aikaväli osuu kuitenkin myös Camelidae-suvun maksimaalisen monimuotoisuuden kanssa, joka ajoittui varhaiselle galerialle19. Tämä korrelaatio tukee dromedaarin esi-isän sopeutumista ympäristön muutoksiin ja sen populaation laajenemista keskipleistoseenin siirtymävaiheessa. Viimeisin taantuma baktriankamelin esi-isän populaatiossa tapahtui ~60 tuhatta vuotta sitten (Kya), mikä vastaa nykyihmisen leviämistä Afrikasta Euraasiaan20 , baktriankamelin kotimaahan. Näin ollen ihmisen toiminta on saattanut vaikuttaa baktriankamelin viimeaikaiseen esi-isäpopulaatioon.

Alpakan esi-isän efektiivinen populaatiokoko pieneni asteittain ~5.37 Mya:n, joka on lähempänä Messinian ja Zanclean-vaiheen (5,33 Mya)15 aikarajaa, ja 2,09 Mya:n, joka sijoittuu Uquian-kauteen (3-1,2 Mya), jonka aikana alpakan esi-isä vaelsi Etelä-Amerikkaan Panaman maasillan kautta Suuressa amerikkalaisessa bioottisessa vaihdoksessa21. Tämä viittaa siihen, että vaellus on saattanut osaltaan vaikuttaa alpakan esi-isän populaatiokoon pienenemiseen. Sen populaatiokoko laajeni sitten pleistoseenin aikana, minkä jälkeen seurasi kolme merkittävää pullonkaulajaksoa ennen 501, 139 ja 44 Kya:ta. Populaatio laajeni voimakkaasti noin 72 Kya:ssa, jolloin sen koko oli ~113 × 104 yksilöä. Viimeisin pullonkaula (44 Kya) vastaa viimeistä jääkauden maksimiaikaa (48-25 Kya), joka eteni Etelä-Amerikassa22 ja johti populaation koon dramaattiseen pienenemiseen ~1,2 × 104 yksilöön. Tämä viittaa siihen, että Etelä-Amerikan kylmät olosuhteet tuolloin saattoivat johtaa alpakan esi-isän populaatiokoon supistumiseen pleistoseenin loppupuolella.

geenievoluutio

Seuraavaksi tutkimme kamelidien geenejä, jotka ovat ympäristöön sopeutumisen taustalla. Otimme käyttöön CAFÉ23:n sellaisten geeniperheiden tunnistamiseksi, jotka ovat kokeneet merkittävää laajentumista ja supistumista evoluution aikana (kuva 2 ja täydentävät menetelmät), ja tunnistimme 373 laajentunutta ja 853 supistunutta geeniperhettä dromedaarin genomissa, 183 laajentunutta ja 753 supistunutta geeniperhettä baktriankamelin genomissa ja 501 laajentunutta ja 2189 supistunutta geeniperhettä alpakan genomissa. Monet näiden kolmen kameloidin laajentuneista geeniperheistä ovat merkittävästi rikastuneet soluprosessiin, solun osaan, hajureseptorin aktiivisuuteen, rautaan ja immuunijärjestelmään liittyviin Gene Ontology (GO) -luokkiin (täydentävät kuvat 13-15 ja täydentävät taulukot 36-38). Tunnistimme 287 positiivisesti valikoitunutta geeniä (PSG) baktriankamelissa (Täydentävät tiedot 1), 324 PSG:tä dromedissa (Täydentävät tiedot 2) ja 151 PSG:tä, jotka olivat yhteisiä molemmille genomeille, mikä viittaa samankaltaisiin valintapaineisiin. Arvioitaessa 23 lajissa esiintyvien ortologisten geenien ainutlaatuisia aminohappojäännösmuutoksia havaittiin 350 ja 343 muuttunutta geeniä baktriankamelissa ja dromedaarissa. Useat yliedustetut geeniryhmät, joissa oli ainutlaatuisia aminohappojäännösmuutoksia kameleilla, liittyivät katalyyttiseen aktiivisuuteen, pienten molekyylien sitoutumiseen ja ATP:n sitoutumiseen (täydentävät kuvat 16 ja 17 sekä täydentävät taulukot 39 ja 40). Syntenisten lohkojen analyysin perusteella baktriankamelilla tunnistettiin 190 ja dromedaarilla 126 uutta geeniä. Nämä saadut geenit ovat merkittävästi rikastuneet hajuaistiin ja immuunijärjestelmään liittyviin luokkiin (Täydentävät taulukot 41 ja 42 sekä Täydentävät menetelmät).

Energia- ja rasva-aineenvaihdunta

Koska energia on tärkeää ravinnonpuutteellisilla aavikoilla eläville kameleille, analysoitiin energiaan liittyviin prosesseihin osallistuvien geenien valintaa. Sopeutumisen genominlaajuiset piirteet tunnistettiin GO-kategorioilla, joilla oli linjakohtainen kiihtynyt evoluutio (lisätiedot 3-14). Toisin kuin naudoilla, kolmen kameloidin yhteisiin nopeasti kehittyviin GO-kategorioihin kuuluivat soluvaste insuliiniärsykkeeseen (GO:0032869, P<0.001) ja insuliinireseptorin signalointireitti (GO:0008286, P<0.001) (Supplementary Data 4, 8 ja 14). Lisäksi tunnistimme useita energia-, glukoosi- ja rasva-aineenvaihduntaan liittyviä luokkia, jotka kehittyivät näillä kamelideilla nopeammin kuin naudoilla. Jotkin energiaan liittyvät GO-kategoriat, joiden havaittiin kehittyvän nopeammin baktriankamelilla kuin naudoilla, ovat yhdenmukaisia aiemmin raportoitujen luokkien kanssa3. Lisäksi 13 geenissä, jotka liittyvät mitokondrioiden toimintaan, β-oksidaatioon sekä kolesterolin synteesiin ja kuljetukseen, oli aminohappojäännösten muutoksia, jotka olivat ainutlaatuisia baktriankamelille ja dromedaarille. Useat rasva-aineenvaihduntaan osallistuvat geenit (ACC2, DGKZ ja GDPD4) laajenivat baktriankamelin genomissa, kun taas dromedaarin laajentuneet geeniperheet rikastuivat mitokondrion (GO:0005739, P=2,30 × 10-5) -kategoriaan (lisätaulukko 37).

Kumpareiden erilainen määrä näillä kolmella kamelilla saattaa heijastella niiden toisistaan poikkeavia rasva-aineenvaihdunnan kykyjä. ATP:hen (GO:0006200, GO:0016887, GO:0042626, P<0.01), mitokondrioihin (GO:0005739, GO:0005759, P<0.01), lipidien kuljetukseen (GO:0006869, PBactrian camel=5.33 × 10-5, Pdromedary=0,00016) ja vaste insuliiniärsykkeeseen (GO:0032868, PBaktrian kameli=0,0005, Pdromedary=1,33 × 10-5) kehittyivät nopeasti molemmilla kamelilajeilla verrattuna alpakaan (lisätaulukko 43). Lipidaineenvaihduntaan liittyvät kategoriat kehittyivät nopeammin baktriankamelilla kuin dromedaarilla, esimerkiksi lipidikatabolinen prosessi (GO:0016042, P=0,0015) ja rasvasolujen erilaistuminen (GO:0045444, P=2,54 × 10-9) (lisätaulukko 44). Nämä geenit voivat parantaa kamelin energiavarastointi- ja tuotantokykyä aavikolla, ja ne voivat myös heijastaa eroa rasva-aineenvaihdunnassa ja puolestaan olla yhteydessä kyttyräselän lukumäärään.

Stressireaktio

Tutkiaksemme sopeutumista kuiviin ja kuumiin ympäristöihin analysoimme edelleen stressireaktioihin osallistuvia geenejä. Nautoihin verrattuna DNA-vaurioihin ja korjaukseen (GO:0006974, GO:0003684, GO:0006302, P<0.01), apoptoosiin (GO:0006917, GO:0043066, P<0.01), proteiinien stabilointiin (GO:0050821, PBactrian camel=0.00021, Pdromedary=3,44 × 10-19) ja immuunivasteet (GO:0006955, GO:0051607, P<0,01) osoittivat kiihtynyttä evoluutiota molemmissa kamelilajeissa (täydentävät tiedot 8 ja 14). Alpakaan verrattuna merkittäviä toiminnallisia luokkia tunnistettiin T-solujen yhteistimulaatiolle (GO:0031295, PBactrian camel=8,67 × 10-32, Pdromedary=9,33 × 10-9), hapetus-pelkistysprosesseille (GO:0055114, PBactrian camel=4.88 × 10-15, Pdromedary=5,22 × 10-21) ja oksidoreduktaasiaktiivisuus (GO:0016491, PBactrian camel=2,27 × 10-10, Pdromedary=7,23 × 10-7), joiden kaikkien kehitys kiihtyi molemmilla kameleilla (lisätiedot 6 ja 12). Kolme geeniä (ERP44, NFE2L2 ja MGST2) korreloivat hapetusstressivasteiden kanssa, ja niissä oli ainutlaatuisia aminohappojäännösmuutoksia kummankin kamelin genomissa. Dromedarin laajentuneet geeniperheet rikastuivat sytokromi c -oksidaasiaktiivisuuteen (GO:0004129, P=5,80 × 10-10) ja monooksygenaasiaktiivisuuteen (GO:0004497, P=1,32 × 10-5) (lisätaulukko 37). Nämä tulokset osoittavat, että kamelit ovat valikoituneet sopeutumaan aavikkoympäristön ankariin kuiviin olosuhteisiin.

Hengityselimistön sopeutuminen

Toinen aavikkoympäristön haaste on ilmassa kulkeutuva pöly, joka voi johtaa hengityselinsairauksiin, kuten astmaan. Kolmetoista PSG:tä molemmilla kameleilla, mukaan lukien FOXP3, CX3CR1, CYSLTR2 ja SEMA4A, olivat yhteydessä ihmisten hengityselinsairauksiin. Havaitsimme myös, että keuhkojen kehityksen GO-luokka (GO:0030324, PBactrian camel=3,26 × 10-5, Pdromedary=1,18 × 10-19) (lisätiedot 6 ja 12) kehittyi nopeasti dromedarilla ja baktrian kamelilla verrattuna alpakaan. Näiden geenien valikoituminen antaa lisätodisteita kamelien sopeutumisesta aavikkoympäristön haasteiden kestämiseen.

Näköjärjestelmän sopeutuminen

Aurinkosäteily on toinen aavikkoympäristön piirre. Pitkäaikainen altistuminen ultraviolettisäteilylle voi johtaa useisiin silmäsairauksiin. Tutkimme geenejä, jotka saattavat totuttaa kamelien silmät aavikon äärimmäiseen auringonsäteilyyn, ja havaitsimme positiivista valikoitumista OPN1SW-, CX3CR1- ja CNTFR-geeneissä, jotka liittyvät valon havaitsemiseen ja näön suojaamiseen, molemmilla kameleilla. Tulokset osoittivat myös, että näköhavainto (GO:0007601, PBactrian camel=0,0018, Pdromedary=2,49 × 10-14) kehittyi nopeasti molemmilla kameleilla verrattuna alpakaan (lisätiedot 6 ja 12). Nämä tulokset viittaavat geneettiseen perustaan kamelien kyvylle kestää pitkäaikaista altistumista ultraviolettivalolle ilman näköjärjestelmän vaurioitumista.

Suolan aineenvaihdunta

Keskityimme tämän jälkeen kamelien suolan aineenvaihduntaan tarkastelemalla suolan pääasiallista vaikutusta vesitasapainoon. Toisin kuin aiemmassa suolankestävyyttä koskevassa raportissa3 , tuloksemme osoittivat, että natriumionin kuljetuksen luokka (GO:0006814, PBactrian camel=0,0014, Pdromedary=0,00012) kehittyi nopeammin molemmilla kameleilla kuin naudoilla (lisätiedot 8 ja 14). Jänniteohjattuun kaliumkanavakompleksiin liittyvä luokka (GO:0008076, PBactrian camel=8,77 × 10-8, Pdromedary=2,68 × 10-10) kehittyi nopeasti molemmilla kameleilla verrattuna alpakaan (täydentävät tiedot 6 ja 12). Huomionarvoista on, että baktriankamelin genomissa on kaksi kopiota NR3C2- ja IRS1-geeneistä, joilla molemmilla on kriittinen rooli natriumin takaisinimeytymisessä ja vesitasapainossa munuaisissa24,25,26, kun taas muilla nisäkkäillä on vain yksi kopio kummastakin geenistä. Tämä ero viittaa siihen, että kamelit saattavat metaboloida ja kuljettaa suolaa tehokkaammin kuin alpakat ja naudat, ja nämä reitit ovat tärkeitä veden takaisinimeytymisen kannalta.

Differentiaalisesti ilmentyvät geenit ja rikastumisanalyysi

Saadaksemme lisää tietoa kuivaan aavikkoon sopeutumisen ominaispiirteistä sekvensoimme munuaiskortikaaliset ja medullaariset transkriptomit baktriankameleiden ryhmästä 24 vuorokauden vesirajoitusolosuhteiden (WR) jälkeen sekä kontrolliryhmän (CG) transkriptomit (liitetaulukko 45 ja liitetiedot 15 ja 16). Valitsimme näissä kudoksissa merkittävästi ylös- tai alasreguloituneet geenit (täydentävät kuvat 18-21 ja täydentävät menetelmät) ja analysoimme sitten näiden geenien rikastuneet GO-luokat (täydentävät kuvat 22-25, täydentävät tiedot 17-20 ja täydentävät menetelmät). Munuaiskuoren ylösreguloituneiden geenien joukossa havaittiin yliedustus luokissa, jotka liittyvät metalli-ionien sitomiseen (GO:0046872, P=1,53 × 10-23) ja elimistön nestetasojen säätelyyn (GO:0050878, P=1,37 × 10-6) (Täydentävät tiedot 17). GO-luokat, jotka liittyivät glukoosin aineenvaihduntaan (GO:0006006, P=4,11 × 10-6), glukoneogeneesiin (GO:0006094, P=0,0026), mitokondrioon (GO:0005739, P=2,13 × 10-5), esiastemetaboliittien ja energian tuottamiseen (GO:0006091, P=0,0077), vasteeseen ravintoaineiden määrään (GO:0031667, P=0,0064) ja vasteeseen stressiin (GO:0006950, P=0,0026).0094) rikastuivat ylössäätyneiden munuaisten medullaaristen geenien joukossa (lisätiedot 19).

Natriumin takaisinimeytyminen

Natriumia munuaisissa takaisinimeytyviä Na+/K+-ATPaasia ja epiteliaalista Na+-kanavaa (ENaC) koodaavat geenit olivat ylössäätyneinä munuaiskuoressa ja -välikarsinassa WR-olosuhteissa (lisätaulukot 46 ja 47). ENaC:n alayksiköiden joustava transkriptio eri kudoksissa ja eri olosuhteissa viittaa siihen, että kameli säätelee ENaC:n Na+:n takaisinimeämisaktiivisuutta selviytyäkseen erilaisista fysiologisista vesivaatimuksista. Nämä havainnot viittaavat siihen, että natriumin takaisinimeytymisen säätely voi olla olennaista kamelin selviytymiselle vedenpuutteellisessa ympäristössä.

Vedenvaraus

Kameli on tunnettu sopeutumisestaan pitkäkestoiseen vedenrajoitukseen. Siksi selvitimme vedenvarauksen mekanismia analysoimalla akvaporiiniperheen geenien transkriptiota, jotka ovat selektiivisiä vesikanavia, joilla on tärkeitä tehtäviä veden takaisinimeytymisessä ja aineenvaihdunnassa. AQP1, AQP2 ja AQP3 olivat kolme tärkeintä eri tavoin ekspressoitunutta geeniä munuaiskuoressa ja -välikarsinassa WR-olosuhteissa (lisätaulukot 48 ja 49 sekä lisäkuva 26). Nämä geenit saattavat mahdollistaa sen, että kamelit voivat imeä vettä tehokkaammin takaisin vedenpuutteellisessa ympäristössä. Emme kuitenkaan havainneet AQP4:n mRNA:ta baktriankamelin munuaisissa, mikä on yhdenmukaista sen ilmentymisen puuttumisen kanssa aavikkojyrsijällä Dipodomys merriami merriami27 , mutta toisin kuin sen runsas ilmentyminen ihmisen munuaisissa28. Mielenkiintoista on, että AQP4:ssä havaittiin ainutlaatuinen aminohappojäännösmuutos (R261C) baktriankamelin genomissa (täydentävä kuva 27). Nämä havainnot saattavat viitata ainutlaatuiseen veden takaisinimeytymisen ja aineenvaihdunnan strategiaan kamelin munuaisissa.

Osmoregulaatio

Koska hypertonisuus on perustana vesitasapainolle ja veden takaisinimeytymiselle munuaisissa, analysoitiin sellaisten geenien ilmentymistä, jotka osallistuvat osmoregulaatioon munuaisytimessä. Aktivoitujen T-solujen ydintekijä 5 (NFAT5), ainoa tunnettu nisäkkäiden tonisuuden säätelemä transkriptiotekijä29 , ilmentyi 3,66 prosenttia kontrollitasosta WR-olosuhteissa (lisätaulukko 50). Vastaavasti natrium/myo-inositoli-kotransporterin (SMIT), natrium- ja kloridiriippuvaisen tauriinikuljettajan (TauT) ja natrium- ja kloridiriippuvaisen betaiinikuljettajan (BGT1) ilmentyminen väheni WR-olosuhteissa. Nämä kolme NFAT5:n transaktivoimaa kuljettajaa kuljettavat yhteensopivia orgaanisia osmolyyttejä munuaisten medullaarisoluihin (RMC) vasteena hypertonisuudelle30 (kuva 4). NFAT5:n ja sen kohdegeenien alenevaa säätelyä hypertonisen stressin aikana ei ole havaittu muilla nisäkkäillä29,31 , mukaan lukien aavikkoeläimet, kuten Spinifex-hyppyhiiri (Notomys alexis)32. Tuloksemme viittaavat siihen, että kamelit saattavat turvautua muihin osmoregulaatiostrategioihin suojautuakseen hypertoniselta stressiltä pitkäaikaisen vesirajoituksen aikana.

Organiset osmolyytit

Organisten osmolyyttien kertyminen auttaa RMC:tä tasapainottamaan solunsisäisen ja solunulkoisen ympäristön välistä osmoottista painetta30. TauT:n, BGT1:n ja SMIT:n alaregulaatio merkitsee, että tauriinin, betaiinin ja myo-inositolin kuljetus soluihin vähenee. Huomionarvoista on, että havaitsimme aldoosireduktaasin (AR) transkriptiivisen ylössäätelyn ja sorbitolidehydrogenaasin (SDH) alasäätelyn sorbitolireitillä; havaitsimme myös neuropatiakohdeesteraasin (NTE) transkriptiivisen ylössäätelyn ja glyserofosfodiesterifosfodiesteraasidomeenin sisältävän proteiini 5:n (GDPD5) vakaan transkriptiosuunnan glyserofosfoliinin (GPC) reitillä (kuva 4 ja lisätaulukko 50). Näiden geenien ilmentymismallit viittaavat siihen, että kamelissa sorbitolia ja GPC:tä voi kertyä WR-olosuhteissa ja että osmolyytit voivat olla pääasiassa RMC:iden itsensä tuottamia. Sorbitoli voi toimia energianlähteenä33 ja auttaa tasapainottamaan korkean solunulkoisen NaCl:n aiheuttamaa osmolaliteettia34; GPC:n kertymisen energiakustannukset vasteena korkeaan NaCl:n tai urean määrään munuaisytimessä30 voivat olla pienemmät kuin betaiinin kuljettaminen soluihin korkeaa konsentraatiogradienttia vastaan30. Näin ollen nämä vaihtelut osmolyytteihin liittyvien geenien ilmentymisessä viittaavat siihen, että vasteena hypertonisuuteen käytetään pääasiassa kahta osmolyyttiä eikä viittä osmolyyttiä osana vähäisen energiankulutuksen mallia, jonka avulla kamelit selviytyvät ravinnon niukkuudessa aavikolla.

Havaitsimme, että GLUT1:n (glukoosin kuljettaja 1) ja glykolyysiin osallistuvien geenien ilmentymistasot kasvoivat voimakkaasti munuaisten ydinjatkeessa WR:n olosuhteissa (lisätaulukko 51). Yhdessä aikaisemman raportin kanssa, jonka mukaan GLUT1:n ilmentymistaso indusoituu osmoottisen ja metabolisen stressin vaikutuksesta35 , tuloksemme viittaavat siihen, että glukoosin saannin lisääminen ei ainoastaan takaa riittävää glukoosipitoisuutta sorbitolin synteesiä varten, vaan se myös toimittaa energiaa, jota ylössäätynyt Na/K-ATPaasi tarvitsee pitääkseen yllä sisäisen ionigradientin sopeutunutta hypertonisuutta varten (kuva 4). Havaintomme viittaavat siihen, että kameleille ominainen korkea veren glukoosipitoisuus (6-8 mmol l-1)36,37 voi olla evolutiivinen sopeutumisstrategia osmoregulaatiota ja RMC:iden veden takaisinimeytymistä varten antidiureesin aikana.

Osmoprotection

Kun otetaan huomioon solujen mahdollinen hyperosmoottinen vaurioituminen30 , analysoimme solujen suojaamiseen liittyvien geenien ilmentymistä ja havaitsimme, että 25:n antioksidantteja ja niihin liittyviä entsyymejä koodaavan geenin ilmentymistasot (lisätaulukko 52) olivat korkeammat munuaisytimessä WR-olosuhteissa. Antioksidatiivisia transkriptiotekijöitä koodaavien geenien, kuten Nrf2:n, lämpösokkitekijä-1:n, aktivaattoriproteiini-1-kompleksin, p53:n, ydintekijä-κB:n ja transkription signaalinmuuntimen ja aktivaattorin 4, ilmentyminen oli myös kohonnut WR:n munuaisytimessä. Lisäksi tunnistimme 14 lämpösokkigeeniä, jotka edistävät vääristyneiden proteiinien eliminointia hyperosmolaliteetin30 vallitessa ja jotka olivat säänneltyjä WR:n munuaisytimessä (lisätaulukko 52). Sytoprotektiivinen chaperonigeeni klusteriini lisääntyi dramaattisesti, ~8,9-kertaisesti, ja sen transkriptiotaso oli korkein WR:n munuaisytimessä (lukemat kilobasista miljoonaa kartoitettua lukemaa kohti = 27 069). Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että klusteriini indusoituu glukoosin vaikutuksesta38 ja liittyy erilaisiin patologisiin tiloihin, kuten diabetekseen39 ja munuaisvaurioon40. Klusteriinin tunnistaminen PSG:ksi dromedaarilla viittaa siihen, että tällä geenillä voi olla merkittävä rooli kamelin munuaisytimen medullan sytosuojan kannalta veden rajoituksen aikana ja että kamelien korkea veren glukoosipitoisuus voi toimia osmoprotektion aikana. Kaiken kaikkiaan osmoprotektiivisten geenien ylössäätely osoittaa, että kameleilla on kehittynyt osmoprotektiivinen kyky WR-olosuhteissa.