Botulinum-neurotoksiinin ominaisuudet ja havaitseminen
Klostridit tuottavat enemmän erityyppisiä proteiinimyrkkyjä kuin mikään muu mikro-organismien suku. Clostridium botulinum -botulinumin erinomainen ominaisuus on sen kyky syntetisoida poikkeuksellisen tehokasta neurotoksiinia. BoNT:t muodostavat farmakologisesti samankaltaisten toksiinien perheen, jotka sitoutuvat perifeerisiin kolinergisiin synapseihin ja estävät asetyylikoliinin eksosytoosin hermo-lihasliitoksissa. BoNT:tä tuotetaan elintarvikkeissa, suolistossa ja viljelmissä esiasteen toksiinikomplekseina, jotka koostuvat myrkyttömiin proteiineihin yhdistetystä botuliinin neurotoksiinista. Kompleksien myrkyttömien komponenttien on osoitettu lisäävän neurotoksiinin stabiilisuutta ja estävän ruoansulatusentsyymien aiheuttaman inaktivoitumisen suolistossa.
Botulismin diagnoosi tehdään yleensä arvioimalla potilaiden kliinisiä oireita ja elintarvikeperäisten taudinpurkausten yhteydessä sellaisten tapausten kasautumisella, joissa on mukana ryhmä ihmisiä, jotka ovat syöneet yhteistä ruokaa. Useimmissa botulismin tutkimuksissa ensisijaisena tavoitteena on havaita BoNT:n esiintyminen, koska C. botulinum -botulinumin itiöt ovat laajalle levinneet ympäristössä ja saastuttavat monia elintarvikkeita. BoNT:n osoittaminen verestä, mahan sisällöstä ja elintarvikkeista vahvistaa botulismin. C. botulinum -bakteerin eristäminen epäilyttävästä elintarvikkeesta, botulismioireista kärsivien imeväisten ulosteista tai haavoista tukee botulismin diagnoosia. Se ei kuitenkaan useimmissa tapauksissa anna vahvistusta, koska itiöitä löytyy elintarvikkeista ja satunnaisesti terveiden aikuisten ulosteista.
BoNT havaitaan mieluiten elintarvikkeesta tai kliinisestä näytteestä uutetun toksiinin bioanalyysillä. Uutetta ruiskutetaan vatsansisäisesti hiirille, ja eläimiä tarkkaillaan säännöllisin väliajoin botulismin tyypillisten oireiden varalta enintään neljän päivän ajan. BoNT:n määrästä riippuen botulismin oireet ilmenevät yleensä 4-24 tunnin kuluessa. Tyypillisiä oireita ovat eläinten liikkumiskyvyn heikkeneminen, turkin röyhistyminen, hengitysvaikeudet, vatsalihasten supistuminen, joka antaa ”ampiaisen” morfologian, jota seuraa kouristelu ja kuolema. Eläimet, joilla nämä oireet ilmenevät, kuolevat yleensä 24-48 tunnin kuluessa. Eläinten, jotka kuolevat aikaisemmin kuin 2 tunnin kuluessa tai 48 tunnin kuluttua, olisi katsottava menehtyneen muihin aineisiin kuin BoNT:hen. BoNT:n aiheuttama kuolema varmistetaan neutraloimalla se serotyyppispesifisillä antitoksiineilla.
Kliinisistä näytteistä ja tietyistä elintarvikkeista saadun BoNT:n hiirellä tehdyssä biotestissä esiintyy usein komplikaatioita. Erityisesti muiden kuin botuliinia häiritsevien aineiden aiheuttamat kuolemantapaukset ovat yleisiä. Nämä epäspesifiset kuolemantapaukset voidaan yleensä välttää laimentamalla häiritsevä tappava aine loppupisteeseen, jossa kuolema aiheutuu voimakkaamman BoNT:n vaikutuksesta. Toisinaan analysoitavassa näytteessä voi esiintyä useampaa kuin yhtä BoNT:n serotyyppiä, ja varmistaminen edellyttää neutralointia antitoksiinien seoksella. Elintarvikkeissa tai kliinisissä näytteissä muut kuin botuliinikuolemat voivat johtua infektiosta tai endotoksiinien läsnäolosta. Tartunnanaiheuttajat voidaan poistaa kalvosuodatuksella tai lisäämällä antibiootteja testattavaan uutteeseen. Endotoksiineja sisältävät uutteet voidaan yleensä laimentaa sopivaan loppupisteeseen tai endotoksiinit voidaan poistaa adsorptiolla. Proteolyyttisten C. botulinum -kantojen (ryhmä II) uutteiden myrkyllisyyttä lisää proteaasin, kuten trypsiinin, aktivointi. Joissakin elintarvikkeissa trypsiini voi tuottaa myrkyllisiä peptidejä, ja siksi reaktio olisi lopetettava lisäämällä soijapapujen trypsiininestäjää 30-60 minuutin kuluttua.
Viabiloituva C. botulinum voidaan eristää elintarvikkeista rikastamalla sopivassa kasvualustassa, kuten keitetyn lihan ja glukoosin liemessä tai peptoneja, hiivauutetta ja glukoosia sisältävässä väliaineessa. C. botulinumilla on monimutkaiset ravinnevaatimukset, ja se tarvitsee kasvuunsa rikasta elatusainetta. Eristämistä varten on usein hyödyllistä lämmittää osa elintarvikkeesta tai kliinisestä näytteestä 80 °C:ssa tai 60 °C:ssa, jotta voidaan valita I ja II ryhmän C. botulinum -itiöt. Toisinaan käytetään 50-prosenttista etanolia inaktivoimaan kasvullisia soluja elintarvikenäytteissä, joista analysoidaan ryhmän II C. botulinum. Rikastuksen jälkeen BoNT:n esiintyminen määritetään hiiren biotestillä aiemmin kuvatulla tavalla. Ryhmän I C. botulinum -bakteerin eristämiseen kliinisistä näytteistä on käytetty selektiivisiä eristysagareita, jotka sisältävät antibiootteja, kuten sykloseriinia, sulfametoksatsolia ja trimetopriimia.
BoNT:n osoittamiseksi on kehitetty erilaisia immunologisia menetelmiä, mutta useimmat niistä eivät ole yhtä herkkiä kuin hiiren biotesti, ja niiden mahdollisena haittapuolena on myös se, että niillä voidaan havaita biologisesti inaktiivinen BoNT. Entsyymivälitteisissä immunosorbenttimäärityksissä (ELISA) on saavutettu useita edistysaskeleita näiden haittojen lieventämiseksi, ja on todennäköistä, että ELISA-menetelmää käytetään täydentämään mutta ei korvaamaan hiiren biotestiä.