Abstract
Tässä tutkimuksessa tutkitaan mekanismia, joka on taustalla sinkin hedelmällisyyttä parantavan vaikutuksen taustalla lihavilla rotilla proteomiikan avulla. Kolmen eri ZnSO4-annoksen vaikutuksia spermatogeneesiin ja hormonitasoihin tutkittiin. Kivesten spermatogeneesiä havainnoitiin HE-värjäyksellä. Seerumin estrogeeni- ja testosteronitasot mitattiin kemiluminesenssimikropartikkeli-immunomäärityksellä. Sperman proteomianalyysi tehtiin nestekromatografia-massaspektrometrialla. DAVID-tietokantaa käytettiin GO-rikastumisanalyysin ja KEGG-polkuanalyysin suorittamiseen eri tavoin ilmentyneistä geeneistä, ja STRING-verkkotietokantaa käytettiin PPI-verkon rakentamiseen. ZnSO4-käsiteltyjen rottien ryhmän siittiöiden määrä, siittiöiden liikkuvuus ja testosteronihormonit lisääntyivät. ZnSO4 paransi kivesten rakennetta ja lihavuuden aiheuttamia spermatogeneesin poikkeavuuksia. Proteomianalyysi osoitti, että ZnSO4-käsitellyn ryhmän ja liikalihavuusryhmien yhteensä 6 spermanäytteessä oli 401 eri tavoin ilmentyvää proteiinia. Differentiaaliset proteiinit syötettiin DAVID-sivustolle. Sen jälkeen 341 tunnistettua proteiinia luokiteltiin niiden biologisten toimintojen mukaan. KEGG-analyysi osoitti, että rikastuneisiin signaalireitteihin kuuluivat glykolyysi/glukoneogeneesi, hiiliaineenvaihdunta, sitraattikierto, rasvahappoaineenvaihdunta ja pyruvaattiaineenvaihdunta. Joidenkin proteiinien osoitettiin liittyvän valiinin, leusiinin ja isoleusiinin hajoamisreitteihin. STRING-analyysillä saatiin 36 solmuproteiinia. Cytoscape-analyysi osoitti, että nämä proteiinit osallistuivat pääasiassa yhdeksään verkostoon, joihin kuuluivat aineenvaihduntaprosessi, hapetus-pelkistys, aerobinen hengitys, RNA:n pilkkominen ja glutationikonjugaatio. ZnSO4 voi parantaa lihavien urosrottien hedelmällisyyttä säätelemällä aineenvaihduntaan, tulehdukseen ja siittiöiden kypsymiseen liittyvää proteiinien ilmentymistä.
1. Johdanto
Ylipaino liittyy urosten hedelmättömyyteen. Miesten hedelmättömyysasteen lisääntymisen, siemennesteen laadun heikkenemisen ja lihavuuden lisääntymisen välillä on tietty ajallinen johdonmukaisuus . Lihavuus johtaa patologisiin muutoksiin kivesten ultrastruktuurissa, ja spermatogeenisten solujen apoptoosi lisääntyy merkittävästi . Kypsien siittiöiden määrän väheneminen voi olla yksi syy, joka johtaa lihavien ihmisten heikkoon spermatogeeniseen kykyyn.
Ylihavilla ihmisillä on hivenaine-aineenvaihdunnan häiriöitä. Hivenaineaineenvaihdunnan häiriötaso elimistössä aiheuttaa vastaavat vaikutukset rasva-aineenvaihduntaan. Miehen lisääntymisjärjestelmässä sinkki-ionit jakautuvat pääasiassa kiveksissä, lisäkiveksissä, eturauhasessa ja siemennesteessä. Sinkki on eturauhasen toiminnan merkkiaine. Lisäksi se säätelee siittiöiden toimintaa, toimii useimpien entsymaattisten reaktioiden kofaktorina ja auttaa ylläpitämään siittiöiden liikkuvuutta. Sinkillä on myös tärkeä rooli kivesten kehityksessä ja siittiöiden muodostumisessa . Sinkin puute lisää merkittävästi sukusolujen apoptoosia hiiren kiveksissä ja aiheuttaa spermatogeneesin pysähtymisen ja hedelmöityshäiriöitä . Tutkimukset ovat osoittaneet, että lihavilla miehillä on 3,5 kertaa todennäköisemmin oligozoosospermia kuin normaalipainoisilla miehillä . Sinkkilisä voi vähentää lihavien ihmisten painoa. Veren glukoositilanne (paastoverensokeri), veren rasva-arvot (kokonaiskolesteroli, triglyseridipitoisuus, suuritiheyksinen lipoproteiinikolesteroli ja pienitiheyksinen lipoproteiinikolesteroli) ja verenpaine paranevat sinkkilisän jälkeen . Suun kautta otettava sinkkivalmiste voi parantaa sinkkipitoisuutta siemenplasmassa, edistää siittiöiden ydinproteiinin muuntumista (eli lysiinistä arginiiniksi) ja estää siittiöiden ytimen ennenaikaisen depolymerisaation. Se voi parantaa hedelmättömien potilaiden siittiöiden liikkuvuutta ja siemennesteen laatua ilman ilmeisiä sivuvaikutuksia . Proteomiikan soveltaminen ZnSO4-hoidon vaikutusten ymmärtämisessä siittiöiden proteiineihin liikalihavuudessa on kuitenkin vielä vähäistä, ja lisätutkimuksia tarvitaan.
Tässä tutkimuksessa tutkittiin kolmen eri ZnSO4-annoksen vaikutuksia liikalihavien rottien spermatogeneesiin ja hormonitasoihin. Tämän vaikutuksen taustalla olevaa mekanismia analysoitiin edelleen proteomianalyysillä.
2. Materiaalit ja menetelmät
2.1. Tutkimusmenetelmät. Eläimet
Seitsemän viikon ikäiset Sprague Dawley -rotat (paino 180-200 g) ostettiin Hebei Medical Universityn koe-eläinkeskuksesta. Niitä pidettiin 12 tunnin pimeä- / valojaksolla ilmastoiduissa huoneissa (lämpötila, ; kosteus, ) ja niillä oli vapaa pääsy veteen ja eläinten ruokaan. Hebei Institute of Family Planning Science and Technology -instituutin eettinen komitea hyväksyi kaikki eläinkokeet
2.2. Lihavuusmallin perustaminen, eläinten ryhmittely ja näytteenotto
Rotat jaettiin satunnaisesti kahteen ryhmään: normaaliruokintaryhmään (15 eläintä per ryhmä) ja lihavuusmalliryhmään (30 eläintä per ryhmä). Kutakin ryhmää ruokittiin vastaavilla ruokavalioilla 8 viikon ajan, eli normaali ruokavaliota normaaliryhmälle ja runsasrasvaista ruokavaliota lihavuusmalliryhmälle. Rottien ruumiinpainot punnittiin viikoittain ja kirjattiin ylös 8 viikon ajan. Lihavuusmallia pidettiin onnistuneena, kun malliryhmän keskimääräinen ruumiinpaino oli 1,2-kertainen kontrolliryhmään verrattuna. Rottien pituus mitattiin (nenän kärjestä peräaukkoon), ja Lee-indeksi laskettiin kaavalla .
Ylipainomallin luomisen jälkeen mallirotat jaettiin satunnaisesti kahteen ryhmään: lihavuusryhmään ja ZnSO4-käsiteltyyn ryhmään. ZnSO4-käsitellyn ryhmän rotat saivat ZnSO4:ää (Tianjin Yongda Chemical Reagent Company Limited) (3,2 mg/kg/d) 4 viikon ajan suun kautta. Kokeen lopussa mitattiin kunkin ryhmän ruumiinpainot, kivesten paino, lisäkivesten paino ja peritesticulaarinen rasva, ja vatsa-aortasta otettiin verta. Siemennäytteet otettiin kaudaalisesta lisäkiveksestä. Kivekset poistettiin.
2.3. Siemennesteen määrä ja siittiöiden liikkuvuus
Kunkin rotan vasen lisäkudos kerättiin välittömästi uhrauksen jälkeen ja siirrettiin putkeen, joka sisälsi 1 ml lämmintä (37 °C) suolaliuosta. Sitten niitä ravisteltiin 37 °C:ssa 5 minuutin ajan, jotta siittiöiden hajoaminen olisi mahdollista. Noin 10 μl laimennettua siittiöiden suspensiota siirrettiin hemosytometrin kuhunkin laskentakammioon siittiöiden pitoisuuden ja liikkuvuuden määrittämiseksi. Motiliteetti mitattiin liikkuvien siittiöiden (a+b-luokka) prosenttiosuutena kaikista siittiöistä.
2.4. Seerumin paastoglukoosin, veren lipidien ja insuliinin määrittäminen
Kokonaiskolesterolien, triglyseridien, matalan tiheyden lipoproteiinien ja korkean tiheyden lipoproteiinien pitoisuudet seerumista mitattiin Siemens Centaur XP -analysaattorilla kemiluminesensoivalla mikropartikkeli-immunomäärityssarjalla (Medical System Biotechnology Co., LTD). Seerumin paastoglukoosi mitattiin glukoosinmäärityssarjalla (Medical System Biotechnology Co., Ltd., Ningbo, Kiina) ACCUTE TBA-40FR -analysaattorilla (Toshiba Medical Systems Co., Tokio, Japani). Seerumin insuliinipitoisuudet määritettiin kemiluminesenssi-immunomäärityksellä UniCel DxI 800 -järjestelmällä (Beckman Coulter, CA, USA) vastaavilla reagensseilla (Beckman Coulter, CA, USA).
2.5. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Leptiinipitoisuus määritettiin ELISA-pakkauksilla (Multisciences Biotech Co., Ltd., Hangzhou, Kiina). Reaktion lopettamisen jälkeen absorbanssi luettiin 450 nm:ssä.
2.6. HE-värjäys
Kivekset kiinnitettiin Bouinin liuoksessa yön yli. Tämän jälkeen kivekset dehydratoitiin alkoholilla ja upotettiin parafiiniin. Näytteet leikattiin 5 μm:n paksuudelta ja värjättiin HE-värjäyksellä. Kiveksen spermatogeneesiä tarkkailtiin valomikroskoopilla.
2.7. Androgeenihormonien mittaaminen
Serumin estrogeeni- ja testosteronipitoisuudet mitattiin Siemens Centaur XP -analysaattorilla kemiluminesenssi-mikropartikkeli-immunomäärityksellä. Detektiosarja ostettiin Siemens Healthcare Diagnostic Inc:ltä ja Cayman Chemicalilta, Michigan, USA.
2.8. Nestekromatografia-massaspektrometria
Tässä tutkimuksessa käytetyt siittiöproteiininäytteet olivat kolmesta ryhmästä (normaaliryhmä, lihavuusmalliryhmä ja ZnSO4-käsitelty ryhmä). Spermanäytteet kerättiin kaudaalisesta lisäkiveksestä. Lyhyesti sanottuna proteiinit uutettiin lysaattipuskurilla, jossa oli 8 M ureaa, 10 mM DTT ja proteaasi-inhibiittoria. Sonikointi suoritettiin 3-5 minuutin ajan. Supernatantti kerättiin 20000 g:n sentrifugoinnin jälkeen 10 minuutin ajan 4 °C:ssa, ja proteiini kvantifioitiin Bradfordin menetelmällä. Uutettuja proteiineja inkuboitiin 100 mM TEAB:n kanssa 100 μL:aan ja sitten 200 mM TCEP:n kanssa 55 °C:ssa 1 h. Tämän jälkeen lisättiin 5 μL 375 mM jodoasetamidia (IAA). Pimeässä 30 minuutin inkuboinnin jälkeen lisättiin esijäähdytettyä asetonia ja inkuboitiin yön yli -20 °C:ssa. Supernatantti poistettiin varovasti 8000 g:n sentrifugoinnin jälkeen 10 °C:ssa 10 minuutin ajan, ja lysaatin annettiin kuivua huoneenlämmössä 2-3 minuuttia. Lopuksi 100 μg proteiinia, 100 μl 100 mM TEAB-liuosta ja trypsiinientsyymin suhde proteiiniin (1 : 50) sekoitettiin keskenään ja entsyymimädätys suoritettiin yön yli 37 °C:ssa.
Nestekromatografia-massaspektrometria: Osittain sulatetut näytteet otettiin ja liuotettiin liuokseen A (2 % ACN/98 % H2O/0,1 % FA). Sentrifugoinnin jälkeen 20000 g:ssa 30 minuutin ajan otettiin supernatantti ja proteiinisekvenssi detektoitiin EASY-nLC-nestefaasi-Q Exactive -massaspektrometrillä (amerikkalainen Thermo Fisher).
Massaspektrometriaolosuhteet olivat seuraavat: tiedonkeruuaika 90 minuuttia, ruiskutusjännite 2 kV, kapillaarilämpötila 320 °C, normalisoitu törmäysenergia 27 % ja keräysmassan vaihteluväli 300-1400 Da. Ensisijaiset parametrit olivat 70000 resoluutioksi, 36 AGC-kohteeksi, 60 ms maksimi-IT:ksi ja profiili spektrin tietotyypiksi. Toissijaiset parametrit olivat 17500 resoluutiolle, 54 AGC-kohteelle, 80 ms maksimi-IT:lle ja 3,0 m/z eristysikkunalle.
2.9. Tiedonhaku
MaxQuant 1.5.2.8 -hakukoneessa ensimmäinen virhe on 20 ppm, toinen virhe on 0,02 Da. Kiinteä muutos on seuraava. Kysteiini on muutettu karbamidometyyli-Cys:ksi, ja muuttuva muutos on seuraava: Hapetus-M, LysisC tai Trypsin tai Glu-C-digestio. Entsymaattinen pilkkominen sallii enintään 2 puuttuvaa kohtaa. Aukkojen täyttäminen, normalisointi ja eronseulonta () suoritettiin Perseus-ohjelmiston vakioasetuksilla. Yhteensä 1344 proteiinia tunnistettiin ja kvantifioitiin 6 näytteestä molemmista ryhmistä. Zn- ja G-ryhmän eroavista proteiineista saatiin laadullista ja määrällistä tietoa. Perseus-ohjelmisto suoritti -testin ja merkitsevyysanalyysin proteiinien määrällisistä tuloksista ja suhteista. Saatu differentiaaliproteiiniluettelo on seuraava: -testin tulosten ja differentiaalijakauma-analyysin tulosten perusteella saatiin yhteensä 401 merkittävää differentiaaliproteiinia.
2.10. GO (Gene Ontology) ja KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) -analyysi
Differentiaaliproteiini tuotiin DAVID (Functional Annotation Bioinformatics Microarray Analysis) -verkkosivustolle (https://david.ncifcrf.gov/) bioinformatiikan peruslouhintaa varten. DAVIDin tarjoamia verkkotyökaluja käytettiin sellaisten funktionaalisten annotaatiotermien ja polkujen etsimiseen, jotka olivat rikastuneet edellä tunnistetuissa proteiineissa, mukaan lukien solukomponentti, molekyylitoiminto ja biologinen prosessi.
2.11. Proteiinien vuorovaikutusverkostoanalyysi
Erilliset seulotut proteiinit tuotiin STRING-verkkotietokantaan (https://string-db.org/) analysointia varten. Differentiaalinen geenien vuorovaikutusverkostokartta piirrettiin. Vuorovaikutusverkoston tiedot vietiin Cytoscape 3.2 -ohjelmistoon verkon keskussolmuproteiinin määrittämiseksi.
2.12. Verkkosolmuproteiinit. Tilastollinen analyysi
Tiedot näytettiin muodossa . Tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS22.0-ohjelmalla käyttäen yksisuuntaista varianssianalyysiä (ANOVA), jonka arvoa < 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevänä.
3. Tulokset
3.1. Siemennesteen parametrien ja testosteronihormonitason muutokset siemennesteessä ZnSO4-käsittelyn jälkeen
Kontrolliryhmään verrattuna lihavuusryhmän rottien ruumiinpaino, peritesticulaarinen rasva, Lee-indeksi, kokonaiskolesterolit, triglyseridit, suuritiheyksinen lipoproteiini ja leptiini sekä ZnSO4:llä käsitellyn ryhmän rottien leptiini kasvoivat merkittävästi. Verrattuna kontrolliryhmään lihavuusryhmän rottien matalan tiheyden lipoproteiini väheni merkittävästi. Lihavuusryhmään verrattuna ZnSO4-käsitellyssä ryhmässä ruumiinpaino, peritesticulaarinen rasva ja Lee-indeksi laskivat, ja ero oli tilastollisesti merkitsevä (taulukko 1). ZnSO4:n vaikutusten havaitsemiseksi rottien hedelmällisyyteen kunkin ryhmän siemennesteen parametrit arvioitiin ensin WHO 2010 -kriteerien mukaisesti. Siittiöiden määrä ja siittiöiden liikkuvuus estyivät liikalihavuusryhmässä, kuten taulukossa 2 on esitetty. Lihavuusryhmään verrattuna ZnSO4-käsiteltyjen rottien siittiöiden määrä ja siittiöiden liikkuvuus kasvoivat, mikä viittaa siihen, että ZnSO4 parantaa siemennesteen parametreja lihavilla rotilla. Lihavuus itsessään voi aiheuttaa veren rasva-arvojen nousua, mutta tuloksemme osoittivat, että veren glukoosi-, veren rasva- ja insuliinitasot eivät saavuttaneet diabeteksen tasoa. Voidaan katsoa, että diabeettisten komplikaatioiden sekoittavat tekijät suljettiin pois. Lisäksi havaitsimme seerumin testosteronipitoisuuden. Tulokset osoittivat, että testosteronihormonit lisääntyivät ZnSO4-käsitellyssä ryhmässä verrattuna liikalihavuusryhmään (taulukko 2). Näin ollen ZnSO4-hoito voisi parantaa lihavien rottien siemennesteen laatua.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
Huom: # verrattuna normaaliin kontrolliin; verrattuna lihavuuteen.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
Huom: verrattuna normaaliin kontrolliin; verrattuna lihavuuteen.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||
3.2. Vertailun tulokset. ZnSO4-hoito parantaa lihavuuden aiheuttaman kivesten vajaatoiminnan toipumista
Sen jälkeen suoritimme kiveskudoksen histologisen analyysin, ja tulokset on esitetty kuvassa 1. Kiveksen histologian mukaan normaali ryhmä osoitti normaalia spermatogeneesiä (kuvat 1(a) ja 1(d)), kun taas lihavuusryhmä osoitti häiriintynyttä spermatogeneesiä, sillä siemennesteen tubuluksen luumen oli lähes tyhjä (kuvat 1(b) ja 1(e)). Kuten odotimme, ZnSO4-käsitellyssä ryhmässä kivesten histologia parani merkittävästi liikalihavuusryhmään verrattuna, sillä Sertolin ja Leydigin solut olivat normaalit ja spermatogeneesi oli häiriötön (kuvat 1(c) ja 1(f)). Näin ollen ZnSO4 voi parantaa lihavuuden aiheuttamia kivesten rakenteen ja spermatogeneesin poikkeavuuksia.
3.3. 341 sperman proteiinin luokittelu bioinformatiikan avulla:
Erilaisesti ilmentyneiden proteiinien määrittämiseksi suoritettiin proteomianalyysi. Yhteensä 1344 proteiinia tunnistettiin ja kvantifioitiin yhteensä 6 spermanäytteestä ZnSO4-käsitellystä ryhmästä ja liikalihavuusryhmästä. Perseus-ohjelmisto suoritti -testin ja differentiaalisen merkitsevyysanalyysin proteiinien kvantitatiivisista tuloksista ja suhteista. Merkitseviä proteiineja saatiin yhteensä 401. Differentiaaliset proteiinit syötettiin DAVID-verkkosivustolle ZnSO4-käsitellyn ryhmän ja liikalihavuusryhmän proteiinien toiminnan erojen selvittämiseksi. GO-luokittelussa analysoitiin 371 proteiinia, ja 30 proteiinia ei vastannut. Tämän jälkeen 341 tunnistettua proteiinia luokiteltiin niiden biologisten toimintojen mukaan. Käytimme DAVIDin tarjoamia verkkotyökaluja etsiessämme toiminnallisia annotaatio-termejä ja polkuja, jotka olivat rikastuneet edellä tunnistetuissa proteiineissa. Näiden analyysien tulokset esitetään kuvassa 2. Keskityimme solukomponentin, molekyylitoiminnon ja biologisen prosessin ontologiaan funktionaalisen annotaatiotermin rikastumisanalyysin kanssa ja .
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
Ryhmässä ”solukomponentti” (kuva 2(a)) kategoria-analyysi osoitti, että 59 % proteiineista, joissa oli merkittäviä eroja, oli organellien komponentteja ja 60,7 % niistä oli organellien ainesosia. Lisäksi 29,6 % proteiineista kuului makromolekyylikompleksiin. ”Molekyylitoimintojen” GO-termistöanalyysi osoitti, että 22 prosenttia proteiineista luokiteltiin proteiineiksi, joilla on katalyyttinen aktiivisuus (kuva 2(b)). Muut proteiinit voitiin luokitella proteiinien sitoutumiseen, rRNA:n sitoutumiseen ja entsyymien sitoutumiseen. ”Biologisen prosessin” tietokannan osalta (kuva 2(c)) suurin osa 24 prosentin proteiineista liittyi aineenvaihduntaprosessiin. Lisäksi proteiinit liittyivät kuljetukseen, signaalinsiirtoon, solukuolemaan, solujen adheesioon, immuunijärjestelmän prosessiin ja lisääntymiseen. Signaalipolkuanalyysin tulokset (kuva 2(d)), joissa on keskittyneitä proteiineja ja rikastumia, ovat seuraavat. Useat aineenvaihduntareitit, kuten glykolyysi/glukoneogeneesi, hiiliaineenvaihdunta, sitraattikierto (TCA-kierto), rasvahappoaineenvaihdunta ja pyruvaattiaineenvaihdunta, ovat häiriintyneet ja vaikuttaneet, ja joidenkin proteiinien on osoitettu liittyvän valiinin, leusiinin ja isoleusiinin hajoamisreitteihin
3.4. Sinkkivaikutukset tunnistetaan edelleen eri tavoin ilmentyneiden siittiöproteiinien avulla
Kvantifiointianalyysi suoritettiin proteiinitasojen vertailemiseksi kolmen ryhmän välillä. Erilaisista proteiineista valittiin metaboliset, sinkin kuljetukseen liittyvät proteiinit ja verkoston solmuproteiinit (taulukko 3). Proteiinit, joissa oli tilastollisesti merkitseviä muutoksia, on esitetty kuvassa 3. Nämä proteiinit olivat ARG2, COX5B, ZNT1, LYAR ja TM165. Lihavuusryhmään verrattuna ARG2:n, COX5B:n ja ZNT1:n ilmentyminen ZnSO4-käsitellyssä ryhmässä väheni merkittävästi, kun taas LYAR:n ja TM165:n ilmentyminen lisääntyi merkittävästi.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3.5. Differentiaalinen proteiinien vuorovaikutusverkosto luodaan STRING-verkkotietokannan avulla
STRING on online-analyysiohjelmisto, joka analysoi ja ennustaa tunnettujen proteiinien välistä vuorovaikutusta. STRING-ohjelmisto luo pisteytysmekanismin, jolla eri tietolähteille tehdään vastaavat painotukset, ja lopulta se antaa kattavan pistemäärän ja rakentaa sitten proteiini-proteiini-interaktioiden verkkokartan . Seulotut 341 erilaista proteiinia tuotiin STRING (http://string-db.org/) -verkkotietokantaan analysoitavaksi, ja 341 proteiinia tunnistettiin, ja erilainen geenien vuorovaikutusverkostokartta luotiin. Tämän jälkeen vuorovaikutteiset verkkotiedot vietiin Cytoscape 3.2 -ohjelmistoon verkon keskussolmuproteiinin määrittämiseksi. Voidaan nähdä, että differentiaalisen proteiinikoostumuksen verkosto on monimutkainen (kuva 4). Tämän jälkeen käytimme Cytoscape-lisäosaa analysoidaksemme verkoston solmuproteiinit, ja analyysin tuloksena saatiin yhteensä 36 solmuproteiinia (taulukko 3). STRINGin avulla tuotetusta huippuverkkojen luettelosta valitsimme aliverkot. Cytoscape-analyysi osoitti, että nämä proteiinit osallistuivat pääasiassa yhdeksään verkostoon, mukaan lukien aineenvaihduntaprosessi, hapettuminen-pelkistyminen, aerobinen hengitys, RNA:n pilkkominen ja glutationikonjugaatio.
4. Keskustelu
WHO määrittelee ylipainoiseksi tai lihavaksi henkilön, jolla on epänormaalia tai liiallista rasvakertymää, ja tämä tila muodostaa kasvavan uhan ihmisten terveydelle maailmanlaajuisesti . Joidenkin raporttien mukaan lihavuuden määrä kasvaa nopeasti , mikä ei ainoastaan lisää sairauksien riskiä vaan samalla myös lisää potilaiden riskiä sairastua lisääntymishäiriöihin. Kun miesten lisääntymistoiminta heikkenee maailmanlaajuisesti , yhä useammat ihmiset ovat huomanneet, että lihavuus heikentää siemennesteen laatua. BMI:n kasvaessa siemennesteen parametrit muuttuvat, mikä muuttaa siittiöiden fyysistä ja molekyylirakennetta. Aiemmissa tutkimuksissa on havaittu, että korkea BMI vaikutti haitallisesti siittiöiden pitoisuuteen ja liikkuvien siittiöiden kokonaismäärään . Tässä tutkimuksessa lihavuusryhmiin kuuluvilla rotilla siittiöiden konsentraatio ja siittiöiden liikkuvuus vähenivät merkittävästi verrattuna normaalipainoiseen ryhmään, kun taas ZnSO4 paransi siemennesteen parametreja verrattuna lihavuusryhmään.
Sukupuolihormonien epätasapaino voi vaikuttaa urosten lisääntymiseen, ja ylipainoinen tila voi vaikuttaa miesten hormonitasoihin . Samanaikaisesti tutkimukset ovat osoittaneet, että lihavuus liittyy läheisesti hormonaalisiin häiriöihin, kuten sukupuolihormonien poikkeavuuksiin . Miesten lihavuus vaikuttaa kielteisesti miesten lisääntymismahdollisuuksiin hormonitasojen muutosten vuoksi . Siksi testasimme seerumin tasot kussakin ryhmässä. Testosteronihormonit lisääntyivät ZnSO4-käsitellyssä ryhmässä verrattuna normaali- ja liikalihavuusryhmiin. Näyttää siltä, että ZnSO4-hoito nosti androgeenihormonitasoja merkittävästi vastaamaan normaalin kontrolliryhmän tasoa. ZnSO4-käsiteltyjen rottien pienentynyt ruumiinpaino ja veren rasva-arvot saattavat korjata Leydigin soluja, mikä lisää testosteronitasoa. Tämän seurauksena toimiva urospuolinen lisääntymisjärjestelmä voidaan elvyttää, mikä auttaa spermatogeneesiä ja kivesten rakenteen uudistumista . Ilmeisesti ZnSO4-käsitellyn ryhmän kivesten histologia on parantunut, kun Sertolin ja Leydigin solut ovat regeneroituneet ja siittiöt ovat palautuneet luumeniin. Näin ollen laajamittainen vertaileva proteomiikka tarjoaa tehokkaan lähestymistavan proteiiniekspressioerojen tunnistamiseen liikalihavuuden ja ZnSO4-käsiteltyjen ryhmien välillä. Tutkimuksessamme tunnistettiin eroja proteiinien ilmentymisprofiileissa normaalien hedelmällisten siittiöiden ja ZnSO4-käsiteltyjen ryhmien siittiöiden välillä.
GO-annotaatioanalyysi osoitti, että 24 % proteiineista liittyi aineenvaihduntaprosessiin ja 22 % proteiineista luokiteltiin proteiineiksi, joilla on katalyyttinen aktiivisuus. Muut proteiinit luokiteltiin proteiineja sitoviksi, rRNA:ta sitoviksi ja entsyymiä sitoviksi, mukaan lukien ATP:n sitominen. On hyvin tiedossa, että ATP:tä sitovilla proteiineilla on perustavanlaatuinen rooli biologisissa prosesseissa, mikä osoittaa muutoksia synteettisissä ja metabolisissa prosesseissa. Mitokondriot ovat organelleja, jotka tuottavat energiaa (ATP) soluille. Mitokondriot ovat myös oksidatiivisen stressin ensisijainen kohde. Miehen elimistössä mitokondriot ovat tärkein energialaitos spermatogeenisten solujen kypsymisprosessissa ja tarjoavat myös energiaa siittiöille siemensyöksyn jälkeen. Siksi, kun lihavilla miehillä esiintyy oksidatiivista stressiä, siittiöiden mitokondriot voivat vaurioitua suuresti. Siittiöt ovat alttiita oksidatiiviselle stressille, eikä niillä ole kykyä korjata vaurioita. Runsaasti rasvaa sisältävä ruokavalio aiheuttaa oksidatiivista stressiä lihavilla rotilla, mikä aiheuttaa vaurioita siittiöiden mitokondriokalvoille ja vaikuttaa mitokondrioiden toimintaan . Egwurugwu et al. päättelivät, että sinkkisulfaatilla oli joitakin merkittäviä myönteisiä vaikutuksia androgeeniin ja siittiöiden laatuun fysiologisilla annoksilla. Se oli kuitenkin haitallinen suuremmilla annoksilla.
ARG2:n tiedetään paikallistuvan mitokondrioihin . Sillä on myös ratkaiseva rooli ornitiinin tuotannossa, joka on proliinin, hydroksiproliinin ja polyamiinin esiaste ja joka on välttämätön solujen lisääntymiselle. Lihavuudelle ja siihen liittyville sairauksille on ominaista kroonisen tulehduksen alhainen taso . ARG2 edistää proinflammatorisia vasteita makrofageissa ja vaikuttaa osaltaan ateroskleroosin ja lihavuuteen liittyvän insuliiniresistenssin näyttöön . Uskomme, että varhainen liikalihavuus voi johtaa arginaasin ylössäätelyyn, mikä johtaa systeemisiin muutoksiin arginaasissa ja arginiinin aineenvaihduntatuotteissa. ARG2:n regulaatio liikalihavien ryhmässä voi liittyä solujen lisääntymiseen ja liikalihavuuden aiheuttamaan krooniseen tulehdukseen. Arginaasi parantaa lihavuuden aiheuttamia maksan rasva- ja systeemisiä rasvapoikkeavuuksia estämällä maksan triglyseridimetaboliaan ja mitokondrioiden toimintaan osallistuvien reittien aktivoitumista .
Näistä proteiineista erityisesti COX5B on erittäin kiinnostava, ja se liittyy mitokondrioiden toimintaan ja solujen energiantuotantoon . Sytokromioksidaasi (COX, kompleksi IV) on mitokondrioiden elektroninkuljetusketjun entsyymi, joka sijaitsee mitokondrioiden sisemmässä kalvossa, ja sen toimintaa tarvitaan tuottamaan protonin liikkeellepanovoima, joka ohjaa ATP-synteesiä. Se on yksi sytokromioksidaasin eli mitokondrion hengitysketjun kompleksi IV:n kolmesta mitokondriaalisesta isomuodosta. COX5B osallistuu oksidatiivisen fosforylaation viimeiseen vaiheeseen, jossa tuotetaan H2O:ta, ja ATP:n tuottamiseen tarvittavan sähkökemiallisen gradientin ylläpitoon. Näin ollen ARG2:n ja COX5B:n alentuneet tasot sinkkisulfaattia saaneilla rotilla voivat viitata sinkin aiheuttamaan vaikutukseen lihavien rottien hedelmällisyyteen, erityisesti kivesten regeneraatioon, spermatogeneesiin ja siittiöiden liikkuvuuteen.
Jotkut tässä tutkimuksessa tunnistetut differentiaalisesti ekspressoituneet proteiinit osallistuvat sinkin kuljetusprosessiin. Esimerkiksi Elgazar et al. havaitsivat, että ZnT1 esiintyy tukisolujen plasmakalvolla ja sytoplasmassa. Tutkimukset ovat osoittaneet, että Znt1:llä on tärkeä rooli sinkin homeostaasissa aikuisilla hiirillä . Metalliin reagoivalla transkriptiotekijä-1:llä (MTF-1) on rooli solujen vasteiden koordinoinnissa metallien homeostaasiin ja oksidatiiviseen stressiin. MTF-1 on sinkistä riippuvainen transkriptiotekijä, joka stimuloi metallotioneini- ja sinkinkuljettaja-1 (ZNT-1) -geenejä sinkkipitoisuuden kasvaessa . Foster et al. osoittivat, että sinkkikuljettajan mRNA:n suhteellinen ilmentyminen oli hyvin vaihtelevaa. ZnT1 on runsain kiveksissä, ja sillä on vuorovaikutusta sinkin kuljetuksessa plasmakalvon läpi. Noh et al. raportoivat, että ZnT1:n mRNA-tasot olivat lievästi koholla lihavilla naisilla, ja sinkkikuljettajan muutokset voivat liittyä myös lihavuuteen liittyviin tulehdustiloihin.
Ly1-vasta-aineen reaktiivisen homologin (LYAR) kuvasivat ensimmäisen kerran Su et al. hiiren T-soluleukemialinjasta eristettynä sinkkisormiproteiinia koodaavana cDNA:na . Lyar-geeni, jonka tiedetään ilmentyvän runsaasti kiveksissä, koodaa nukleolaarista proteiinia, joka sisältää LYAR-tyyppisen C2HC-sinkkisormimotiivin ja kolme ydinalueen lokalisointisignaalia. Lee et al. havaitsivat, että LYAR-proteiinia esiintyi spermatosyyteissä ja spermatideissa, mutta ei siittiöissä. Havaitsimme kuitenkin LYAR-ekspression siittiöissä, ja sen ilmentyminen väheni lihavien rottien siittiöissä ja lisääntyi ZnSO4-käsitellyissä ryhmissä. LYAR:n on todettu liittyvän sytoplasmisiin ribosomeihin urospuolisissa sukusoluissa ja syöpäsoluissa, ja se osallistuu preribosomaalisen RNA:n prosessointiin ytimessä . LYAR moduloi toista translaation käynnistymisen kahdesta perusvaiheesta nisäkkäiden urospuolisissa sukusoluissa ja tietyissä kasvaintyypeissä . LYAR hillitsee huomattavasti hapetusstressigeenien, kuten SLC7A11:n, HMOX1:n ja CHAC1:n, transkriptiota. Myc-onkoproteiini säätelee LYAR:n ilmentymistä aktivoimalla sen geenin transkriptiota, ja LYAR:n säätely puolestaan suojaa syöpäsoluja oksidatiivisen stressin välittämältä apoptoosilta vähentämällä CHAC1-geenin ilmentymistä .
Transmembraaniproteiini 165 (TM165) on Golgin transmembraaniproteiini , ja sen puutos aiheuttaa synnynnäisen glykosylaatiohäiriön. TM165 on sekä transkriptiivisesti että translatorisesti yliekspressoitunut hepatosellulaarisessa karsinoomassa ja liittyy hepatosellulaarisen karsinooman invasiiviseen kykyyn . Viimeaikaisessa tutkimuksessa saadut tiedot antavat kuitenkin useita viitteitä sen osuudesta kalsiumin ja mangaanin homeostaasiin . TM165 toimittaa Ca2+:a ja Mn2+:a Golgi-kompleksiin H+:n vastineeksi laktoosisyntaasin ja mahdollisesti muiden glykosyylitransferaasien toimintojen ylläpitämiseksi . Ihmisen Golgin proteiini TM165 voi kuljettaa kalsiumia ja mangaania hiiva- ja bakteerisoluissa . Tutkimuksessamme havaittiin, että TM165:n ilmentyminen lihavilla rotilla väheni ja lisääntyi sinkkilisän jälkeen, mikä viittaa siihen, että TM165 lisääntyi sinkkilisän jälkeen.
5. Johtopäätökset
Johtopäätöksenä tämän tutkimuksen tulokset antavat näyttöä siitä, että ZnSO4 voi parantaa hormonitasoja, kivesten uudistumista ja hedelmällisyyttä. Proteomianalyysi osoittaa lisäksi, että ZnSO4 voi parantaa lihavien urosrottien hedelmällisyyttä säätelemällä aineenvaihduntaan, tulehdukseen, siittiöiden kypsymiseen ja muihin vuorovaikutussuhteisiin liittyvää proteiinien ilmentymistä.
Tietojen saatavuus
Tämän tutkimuksen tulosten tueksi käytetyt tiedot ovat saatavissa pyynnöstä.
Paljastukset
Rahoittavalla taholla ei ollut mitään osuutta tutkimussuunnittelun suunnitteluun, tiedonkeruuseen ja -analyysiin, päätöksentekoon tutkimuksen julkaisemisesta tai käsikirjoituksen valmisteluun.
Interressiristiriidat
Tekijät ilmoittavat, ettei tämän artikkelin julkaisemiseen liittyen ole eturistiriitoja.
Kiitokset
Tämä tutkimus sai tukea Hebein maakunnan hallituksen rahoittamasta kliinisen lääketieteen huippulahjakkuuksien koulutus- ja perustutkimushankkeesta (apuraha nro 20170183).