Abstract

Tutkimme vanadiumsulfaatti (VOSO4) -hoidon vaikutuksia 5 ja 10 mg / kg:n annoksilla 30 vuorokauden ajan endokriinisen haiman aktiivisuuteen ja histologiaan ei-diabeettisilla ja STZ:n aiheuttamilla diabeettisilla rotilla. Diabeettisessa ryhmässä veren glukoosipitoisuus nousi merkittävästi, kun taas insulinemiataso laski selvästi. Hoidon lopussa VOSO4 annoksella 10 mg/Kg normalisoi verensokeritason diabeettisessa ryhmässä, palautti insulinemian ja paransi merkittävästi insuliiniherkkyyttä. VOSO4 lisäsi myös annosriippuvaisesti insuliini-immunopositiivisten beetasolujen määrää ei-diabeettisten rottien haimasaarekkeissa. Lisäksi STZ-diabeettisessa ryhmässä insuliini-immunopositiivisten beetasolujen lukumäärän väheneminen korjaantui saavuttaen kontrollitason pääasiassa suuremmalla vanadiiniannoksella. Näin ollen VOSO4-hoito normalisoi plasman glukoosi- ja insuliinipitoisuuksia ja paransi insuliiniherkkyyttä STZ-kokeellisessa diabeteksessa sekä indusoi beetasolujen proliferaatiota ja/tai regeneroitumista normaaleilla tai diabeettisilla rotilla.

1. Johdanto

Vanadium on siirtymämetalli. On arvioitu, että yli 60 tuhatta tonnia tätä alkuaineita vapautuu vuosittain ilmakehään ihmisen toiminnan seurauksena lähinnä fossiilisten polttoaineiden poltosta .

Saatettuaan verenkiertoelimistöön ruoansulatuskanavan tai hengitysteiden kautta vanadiiniyhdisteet kulkeutuvat transferriinin tai harvemmin albumiinin tai plasman pienimolekyylisten komponenttien, kuten sitraattien ja vähäisemmässä määrin laktaattien tai fosfaattien, mukana . Epäorgaanisilla ja orgaanisilla vanadiinijohdannaisilla on tehty useita tutkimuksia indusoidun diabeteksen eläinmalleissa, joissa tutkittujen yhdisteiden havaittiin vaikuttavan glukoosi-, kolesteroli- ja triglyseridipitoisuuksiin ilman merkittäviä haitallisia sivuvaikutuksia pitkäaikaisessa annostelussa . Useita kokeita tehtiin myös diabeetikoilla, mikä vahvisti vanadiiniyhdisteiden terapeuttisen vaikutuksen veren glukoosipitoisuuksiin vähäisin toksisin vaikutuksin .

Vanadiumin (mukaan lukien vanadyyli ja vanadaatti) on osoitettu alentavan veren glukoosipitoisuutta stimuloimalla glykogeneesiä, glukoosin ottoa ja metaboliaa sekä estämällä glukoosin muodostumista maksan glukoneogeneesin ja glykogenolyysin kautta . Vanadiumilla ja vanadiiniyhdisteillä on todettu olevan insuliinin kaltaista aktiivisuutta jäljittelemällä insuliinin vaikutuksia insuliinireseptorin tyrosiinikinaasiaktivaation ja kinaasifosforylaatiokaskadin reittien kautta . Siksi vanadyylisulfaattia on ehdotettu terapeuttiseksi aineeksi tyypin 1 diabeteksen hoitoon . Streptotsotosiinihoito (STZ) tuhoaa haiman beeta-insuliinia tuottavat solut, ja STZ-indusoituja diabeettisia rottia pidetään tyypin 1 diabetes mellituksen mallina . Vaikka vanadiiniyhdisteillä on osoitettu olevan antidiabeettisia ominaisuuksia STZ-indusoidussa diabeettisessa mallissa, niiden vaikutusmekanismia tutkitaan edelleen. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli tutkia 30 päivän vanadiumsulfaattihoidon vasteita ei-diabeettisilla ja STZ:n indusoimilla diabeettisilla rotilla.

2. Materiaalit ja menetelmät

2.1 . Diabeettisten rottien valmistaminen

Eläimet tehtiin diabeetikoiksi antamalla vatsakalvon sisäinen injektio (ip) STZ:tä kerta-annoksena 65 mg/Kg 0,01 M sitraattipuskurissa (pH 4,5). Tämä ip-menetelmä valittiin viimeaikaisten raporttien perusteella, jotka osoittivat voimakkaan glukoosia lisäävän vaikutuksen STZ-diabeettisilla rotilla .

2.2. Eläimet ja hoito

Urospuoliset Wistar-rotat, 5-6-viikkoiset (paino 175-200 g), ostettiin Tunisian Pasteur-instituutista, ja niitä käytettiin Tunisin yliopiston paikallisen eettisen komitean mukaisesti eläinten käyttöä ja hoitoa varten NIH:n suositusten mukaisesti. Niille annettiin ruokaa (vakiomuotoinen pellettiruokavalio-Badr Utique-TN) ja vettä ad libitum, ja niitä säilytettiin viisi kappaletta häkkiä kohti kerätyssä lämpötilassa (22 °C) 12 tunnin valo-pimeä jaksossa. Rotat jaettiin kuuteen ryhmään.

Ryhmä 1 oli ei-diabeettiset vertailueläimet (ND-kontrolli), ja ne saivat päivittäin vatsakalvon sisäisen injektion (ip) NaCl 9. Ryhmät 2 ja 3 olivat ND ja saivat päivittäin joko 5 tai 10 mg VOSO4/Kg:n annoksen (ND + 5 mg/Kg ja ND + 10 mg/Kg) 30 päivän ajan. Ryhmä 4 oli diabeettinen kontrolli (D-kontrolli), johon annettiin kerta-annoksena 65 mg/Kg STZ:tä. Ryhmät 5 ja 6 koostuivat STZ-diabeetikoista, joille annettiin joko 5 tai 10 mg/Kg VOSO4:ää 30 päivän ajan (D + 5 mg/Kg, D + 10 mg/Kg). STZ-ryhmät hoidettiin VOSO4:llä 48 tunnin STZ-indusoidun diabeteksen jälkeen.

2.3. Biokemialliset määritykset

Kaikki eläimet paastotettiin 12 tuntia ennen glykemian määrittämistä glukometrillä (ACCU-CHEK-Active Roche). Insuliiniherkkyys mitattiin 1 U/Kg insuliinin ip-injektion jälkeen ja veren glukoosipitoisuus määritettiin 30 minuutin välein 2 tunnin aikana prosentteina hormonipitoisuudesta klo .

Eläimet uhrattiin 24 tunnin kuluttua viimeisestä hoidosta ja veri kerättiin ja seerumi käsiteltiin insuliinin arvioimiseksi, joka määritettiin Elisa-pakkauksella (BioVendorin jakelema).

2.4. TUTKIMUKSEN TOTEUTTAMINEN. Immunohistokemiallinen arviointi

Insuliinin immunohistokemiallinen värjäys suoritettiin Langerhansin saarekkeiden beetasolujen eheyden kuvaamiseksi. Tätä varten valittiin Langerhansin saarekkeiden maksimissaan suurempaa pintaa osoittavat kudosleikkeet ryhmien välisiä vertailuja varten. Leikkeet poistettiin ensin parafiinista, hydratoitiin asteittain vähenevällä etanolisarjalla, upotettiin tamponsitraattiin (pH 6) 40 minuutiksi ja inkuboitiin sen jälkeen polyklonaalisella marsun insuliinin vasta-aineella, joka oli laimennettu 50 mM Tris-HCl:ään, pH 7,6 (DAKO). Pesun jälkeen leikkeet inkuboitiin fosfataasikonjugoidulla marsun vasta-aineella, ja paljastusprosessia avustettiin TechMate 500 -laitteella. Lopuksi leikkeet värjättiin hematoksyliini/eosiinivärjäyksellä.

Kymmenen haiman saareketta rottaa kohden tutkittiin mikroskoopilla ja insuliinipositiivisten ja insuliininegatiivisten solujen lukumäärä laskettiin numeroimalla niiden tumat. Tiedot ilmaistaan insuliini-immunopositiivisten solujen prosentteina/solujen kokonaismäärä kussakin saarekkeessa.

2.5. Tilastollinen analyysi

Erojen merkitsevyyttä eri ryhmien välillä arvioitiin yksisuuntaisella varianssianalyysillä (ANOVA), jota seurasi Tukeyn monivertailutesti, ja arvo pidettiin merkitsevänä tasolla.

3. Tulokset

VOSO4-hoidon vaikutus ei-diabeettisten (ND) ja diabeettisten (D) rottien verensokeripitoisuuksiin on esitetty kuvassa 1. Kontrolliryhmän ND:n verensokeriarvoissa ei tapahtunut merkittäviä muutoksia hoidon aikana (kuva 1(a)). ND-rottien käsittely VOSO4:lla 5 tai 10 mg/Kg ei muuttanut merkittävästi verensokeritasoja ensimmäisten 10 päivän aikana. Veren glukoosipitoisuus kuitenkin laski merkittävästi hoidon lopussa annoksella 5 mg/Kg ja laski merkittävästi 15-30 päivän ajan annoksella 10 mg/Kg verrattuna ND-kontrolliryhmään. Päivänä 30 glykemian lasku oli noin 8 ja 15 % vastaavasti annoksilla 5 ja 10 mg/Kg verrattuna kontrolliryhmään. Kuten epäiltiin, STZ-käsitellyillä kontrollirotilla havaittiin huomattava veren glukoosipitoisuuden nousu verrattuna käsittelemättömiin eläimiin ( vs. mg/dl), mikä osoittaa diabeteksen asennusta, joka säilyi koko kokeen ajan. Diabeettisen ryhmän (D) hoito 5 mg/Kg VOSO4:lla alensi merkittävästi verensokeritasoa päivästä 10 alkaen, kun taas 10 mg/Kg:n annos alensi verensokeritasoa merkittävästi ja asteittain päivästä 5 alkaen saavuttaen normaalin tason päivänä 30. Todetut glykemia-arvot 30 päivän kohdalla olivat ja vs. mg/dl vastaavasti D + 5, D + 10 ja kontrolli-D-ryhmissä (kuva 1(b)).

Taulukosta 1 käyvät ilmi insuliinitasot ND- ja D-ryhmissä ilman VOSO4-hoitoa ja sen jälkeen. ND-rotilla, joita hoidettiin 5 mg/Kg VOSO4:lla, ei havaittu merkittäviä muutoksia insuliinitasossa, mutta 10 mg/Kg:lla saatiin selvä nousu verrattuna ND-kontrolliryhmään ( vs. µg/L). Lisäksi kontrolli-D-ryhmässä insulinemia väheni syvästi verrattuna kontrolli-ND-eläimiin ( vs. µg/L). VOSO4:n antaminen D-ryhmille lisäsi insulinemiaa selvästi annosriippuvaisesti. Itse asiassa insuliinitasot nousivat diabeettisilla rotilla 5 mg:n ja 10 mg/Kg:n annoksilla välillä ja µg/L.

Insuliiniherkkyyden muutokset insuliinin (1 U/Kg) ip-injektion jälkeen normaaleissa ja diabeettisesti hoidetuissa eläimissä on esitetty kuvassa 2. ND-rotilla 10 tai 5 mg:n VOSO4-hoito ei muuttanut glykemiaprofiilia vasteena insuliinin antamiseen (kuva 2(a)). Näissä ryhmissä insuliinin suurin hypoglykeeminen vaikutus havaittiin 60 ja 90 minuutissa, ja se oli noin glykemian alkuarvon suuruinen. Matalalla VOSO4-annoksella hoidetuilla diabeetikoilla oli samanlainen glykemiaprofiili kuin kontrolli-D-ryhmällä, jossa glykemia laski maksimissaan 60 minuuttiin mennessä, kun taas suurella annoksella hoidetuilla eläimillä glykemia laski merkittävästi () ja nopeasti maksimissaan 30 minuuttiin mennessä insuliinin injektion jälkeen (kuva 2(b)).

VOSO4-hoitoa saaneilla eläimillä havaittiin, että haiman saarekkeiden koon oli havaittu olleen isompi kuin vastaavissa kontrolloiduissa ND- ja D-luokkien eläimillä (kuvat 3 ja 4). Tilastolliset analyysit osoittivat, että VOSO4-käsittelyt aiheuttivat merkittävän lisäyksen insuliini-immunopositiivisten solujen määrässä noin 20 %:lla ND + 5 ja 27 %:lla ND + 10 mg/Kg-ryhmissä (kuva 5). VOSO4-hoito lisäsi merkittävästi insuliini-immunopositiivisten solujen määrää STZ-diabeettisissa ryhmissä annosriippuvaisesti 12 %:lla 5 ja 23 %:lla 5 ja 10 mg/Kg-annoksilla (kuva 5). STZ-diabeettisesti hoidettujen ryhmien ja ND-kontrollirottien välinen vertailu ei osoittanut merkittäviä eroja.

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Kuva 4

Insuliinin immunohistokemiallinen värjäys haiman Langerhansin saarekkeen beetasoluissa STZ-diabeettisista rotista. Huomaa, että hoidetuilla STZ-diabeettisilla rotilla on enemmän insuliinin immunopositiivisia soluja kuin hoitamattomilla STZ-diabeettisilla rotilla. Kontrolli D (a), 5 mg/Kg VOSO4:lla käsitelty D (b) ja 10 mg/Kg VOSO4:lla käsitelty D (c). Kymmenen saareketta rottaa kohti analysoitiin. Mittakaavapalkki: 50 µm.

Kuva 5

Vanadyylisulfaatin vaikutus beetasolujen määrään %. Arvot edustavat keskiarvoa ± SD. ; vs. ND-kontrolli. ; vs. D-kontrolli. vs. D + 5 mg/Kg. Analysoitiin 10 saareketta rottaa kohti.

4. Keskustelu

Tutkimme vanadiinin antidiabeettisia ominaisuuksia tutkimalla sen vaikutuksia veren glukoosi- ja insuliinipitoisuuksiin sekä endokriinisen haiman B-soluihin.

Käyttämällä STZ-indusoituja diabeettisia rottia osoitimme, että hoito vanadyylisulfaatilla (VOSO4) 5 ja 10 mg/Kg:n annoksilla alensi merkittävästi keskimääräisiä veren glukoosipitoisuuksia 10. ja 5. päivään mennessä verrattuna käsittelemättömään kontrolliryhmään. Päivänä 30 diabeettisilla rotilla, joille annettiin korkeampi annos yhdistettä, oli samanlainen glykemiantaso kuin ND-kontrollieläimillä. ND-rotilla hoito pienemmällä VOSO4-annoksella ei kuitenkaan muuttanut merkittävästi verensokeritasoa, kun taas suurempi annos aiheutti vähäistä ja asteittaista laskua 15. hoitopäivään mennessä, ja glykemia laski noin 14 % 30. päivänä. Tuloksemme ovat sopusoinnussa aiempien tietojen kanssa, jotka osoittavat, että vanadiiniyhdisteiden oraalinen anto STZ:n aiheuttamissa tai geneettisesti periytyvissä tai ravitsemuksellisissa diabeettisissa eläimissä paransi merkittävästi hyperglykemiaa . Ihmisillä Soveid et al. raportoivat suun kautta annettavan vanadyylisulfaattihoidon turvallisuudesta ja tehosta 30 kuukauden aikana tyypin 1 diabeetikoilla vähentämällä insuliinin tarvetta ja verensokeritasoa.

Tutkimuksessamme kävi myös ilmi, että VOSO4:n hypoglykeemiseen vaikutukseen liittyi diabeetikkoryhmässä annosriippuvainen perusinsuliinemiatason huomattava nousu. 10 mg:n annoksella diabeettisten rottien insulinemiataso lähes normalisoitui. Erityisesti vanadiiniyhdisteelle altistuneilla diabeettisilla rotilla todettu veren glukoosipitoisuuden lasku voi liittyä plasman insuliinipitoisuuksien samanaikaiseen nousuun. Nämä tulokset olivat sopusoinnussa aiempien tietojen kanssa, jotka koskevat vanadiiniyhdisteiden tehokkuutta diabeettisen tilan parantamisessa .

Tulevaisuudessa olemme tutkineet vanadiinin antamisen vaikutusta diabeettisten ja ei-diabeettisten rottien insuliiniherkkyyteen. ND-ryhmissä osoitimme insuliinin suurimman hypoglykeemisen vaikutuksen 60-90 minuutin kuluttua hormonin käyttöönotosta. D-ryhmissä VOSO4-hoito 10 mg:n annoksella lisäsi kuitenkin insuliiniherkkyyttä siten, että verensokeri laski nopeammin ja voimakkaammin hormoni-injektion jälkeen, kun taas 5 mg:n annos ei muuttanut merkittävästi D-rottien glykemiavastetta. VOSO4:n aiheuttama parantunut insuliiniherkkyys on linjassa lukuisten tutkimusten kanssa, jotka osoittavat, että vanadiinia voidaan pitää voimakkaana insuliinimimeettisenä tai insuliinitrofisena aineena eri kudoksissa .

On osoitettu, että vanadiiniyhdisteille on ominaista moninaiset vaikutustavat, jotka johtavat verensokerin laskuun . In vivo ja in vitro -tutkimuksissa raportoitiin, että vanadyylisulfaatti lisäsi glukoosin kuljetusta ja aineenvaihduntaa luurankolihaksissa, maksassa ja rasvakudoksissa . Rakenteellisen samankaltaisuutensa ortofosfaattianionien kanssa ansiosta orgaaniset vanadiinijohdannaiset estävät proteiinifosfotyrosiinifosfataasia . Ne estävät myös insuliiniresistenssiä aiheuttavan, insuliiniresistenssiä aiheuttavan insuliinireseptorin defosforylaatiosta vastaavan entsyymin PTP-1B:n toimintaa . Toinen mekanismi, jolla vanadiiniyhdisteet alentavat veren glukoosipitoisuutta, on PKB/Akt-kinaasin aktivoituminen, joka johtaa glukoosin ottamisen lisääntymiseen GLUT4-kuljettimen avulla . PKB/Akt:n aktivoituminen stimuloi myös GSK3:n fosforylaatiota, mikä johtaa glykogeenisynteesin stimulointiin . Toisaalta havaittiin, että C-jun N-terminaalisen kinaasin esto parantaa insuliiniherkkyyttä kokeellisessa diabeteksessa .

Vanadiini lisää glukoosin kuljetusta ja hapettumista sekä insuliinireseptorin tyrosiinikinaasiaktiivisuutta ja vaikuttaa insuliinin kaltaisesti glukoosi- ja rasva-aineenvaihduntaan insuliinista riippuvaisten tai insuliinista riippumattomien biokemiallisten reittien kautta .

On hyvin tiedossa, että STZ-hoito tuhoaa haiman saarekkeiden beetasoluja aiheuttaen insuliiniriippuvaista diabetes mellitusta . Niinpä tässä tutkimuksessa osoitimme, että diabeettisessa ryhmässä haimasaarekkeiden pinta-ala pieneni, mikä liittyi insuliinille immunoreaktiivisten beetasolujen määrän huomattavaan vähenemiseen verrattuna ei-diabeettisiin kontrollieläimiin. Sekä ND- että D-ryhmissä VOSO4-hoito kuitenkin suurensi haimasaarekkeiden kokoa verrattuna vastaaviin kontrolliryhmiin. Mikä tärkeintä, diabeettisten rottien VOSO4-hoito lisäsi annosriippuvaisesti insuliini-immunopositiivisten beetasolujen määrää verrattuna diabeettiseen käsittelemättömään ryhmään, mikä viittaa siihen, että VOSO4 voi synnyttää beetasoluja STZ:n aiheuttamissa diabeettisissa rotissa. Itse asiassa beetasolujen määrä diabeettisten, 5 ja 10 mg:lla VOSO4-käsiteltyjen rottien saarekkeissa ei eronnut merkittävästi ND-ryhmän määrästä. Tämä on sopusoinnussa aiempien tutkimusten kanssa, jotka koskevat tämän yhdisteen haiman insulinotrooppista ominaisuutta . Mielenkiintoista on, että vanadiinihoito lisäsi merkittävästi beetasolujen määrää myös ei-diabeettisten rottien saarekkeissa.

Hiirimallissa, jossa haima oli alloksaaniperfuusioitu segmentti, Waguri ym. raportoivat prosesseja, joissa beetasoluja regeneroituu saarekkeen ulkopuolisista esiasteista. Itse asiassa STZ-diabeettisilla rotilla VOSO4-hoito saattaa stimuloida beetasolujen proliferaatiota saarekkeen sisäisistä endokriinisistä soluista ja erilaistumista saarekkeen ulkopuolisista esiastesoluista.

Johtopäätöksenä tämä tutkimus osoittaa, että vanadyylisulfaatti voisi olla hyödyllinen potentiaalisena diabeteksen vastaisena aineena. Koska nykyiset todisteet ovat kuitenkin vielä rajallisia ja perustuvat enimmäkseen eläinmalleihin ja koska vanadiiniyhdisteiden terapeuttisista formulaatioista ja sivuvaikutuksista tiedetään vain vähän, tarvitaan lisätutkimuksia niiden pitkäaikaisesta käytöstä tavanomaisena hoitona diabeetikoille.

Interressiristiriita

Tekijät ilmoittavat, ettei tämän artikkelin julkaisemiseen liittyen ole eturistiriitoja.

Kiitokset

Tätä työtä on tukenut Tunisian korkeakoulutuksesta ja tieteellisestä tutkimuksesta vastaava ministeriö.