Śluzy w kanale działają dzięki grawitacyjnemu przepływowi wody z jezior Gatún, Alajuela i Miraflores, które są zasilane przez rzeki Chagres i inne. Same śluzy mają jednakową długość, szerokość i głębokość i zostały zbudowane parami, aby umożliwić jednoczesny tranzyt statków w obu kierunkach. Każda brama śluzy ma dwa skrzydła o szerokości 65 stóp (20 metrów) i grubości 6,5 stóp (2 metrów), osadzone na zawiasach. Wysokość wrót wynosi od 46 do 82 stóp (14 do 25 metrów); ich ruch jest napędzany silnikami elektrycznymi wpuszczonymi w ściany śluzy. Są one obsługiwane z wieży kontrolnej, która znajduje się na ścianie oddzielającej każdą parę śluz i z której kontrolowane jest również zalewanie lub opróżnianie komór śluzy. Komory śluz mają 1000 stóp (300 metrów) długości, 110 stóp (33 metry) szerokości i 40 stóp (12 metrów) głębokości.

Z powodu delikatnej natury oryginalnych mechanizmów śluz, tylko małe jednostki mogą przepływać przez śluzy bez pomocy. Większe jednostki są prowadzone przez elektryczne lokomotywy holownicze, które poruszają się po torach zębatych na ścianach śluzy i służą do utrzymywania statków w centralnym położeniu w śluzie. Przed wejściem do śluzy należy przejść przez łańcuch odbojowy, rozpięty między ścianami podejścia. Jeżeli wszystko przebiega prawidłowo, łańcuch ten zostanie zrzucony do rowka na dnie kanału. Jeśli jednak statek porusza się zbyt szybko, łańcuch pozostanie naciągnięty, a statek będzie się o niego ocierał. Łańcuch, który jest obsługiwany przez maszyny hydrauliczne w ścianach, będzie się wtedy powoli rozładowywał przez automatyczne zwolnienie, aż statek zostanie zatrzymany. Jeśli statek oderwie się od lokomotywy holowniczej i przedzierając się przez łańcuch natrafi na pierwszą bramę, druga brama, oddalona o 15 metrów (50 stóp), ochroni śluzę i zatrzyma dalszy ruch statku.

Trzeci system śluz w ramach Projektu Trzeci Zestaw Śluz, rozpoczętego w 2007 roku, został zainspirowany śluzą Berendrecht w Antwerpii w Belgii oraz zbiornikami oszczędzającymi wodę stosowanymi w kanałach w Niemczech. Około 190 000 ton stali, głównie z Meksyku, zostało osadzonych w silnie zbrojonym betonie, aby zbudować komory śluzy po stronie Atlantyku i Pacyfiku, a nowe wrota śluzy mierzą do 33 stóp (10 metrów) szerokości, 98 stóp (30 metrów) wysokości i 190 stóp (58 metrów) długości. Nowe komory i baseny, które będą kontrolować wodę wypływającą z jeziora Gatún, zostały zaprojektowane tak, aby zminimalizować turbulencje przepływu wody i zakłócenia dla przepływających statków. Baseny zostały ukończone w czerwcu 2016 roku i zawierają 158 zaworów składających się z 20 000 ton materiału konstrukcyjnego. Urzędnicy twierdzą, że te wodooszczędne baseny są największe na świecie i ułatwiają ponowne wykorzystanie wody w 60 procentach. Podczas gdy istniejące śluzy zużywają 52 miliony galonów (197 milionów litrów) przy każdym użyciu, nowe śluzy zużywają 48 milionów galonów (182 miliony litrów).