3.53.4.3 Syntetyczna terapia fagowa
Bakteriofagi, lub po prostu nazywane fagami, odegrały główną rolę w rozwoju biologii molekularnej, genetyki bakterii i dostarczaniu najwcześniejszych narzędzi do rekombinacji cząsteczek DNA, takich jak enzymy restrykcyjne i ligazy. W ostatniej dekadzie badania nad mechnizmami oporności fagów doprowadziły do odkrycia jednej z najważniejszych technologii wspomagających SB od czasu PCR; są to systemy nukleaz CRISPR, które bakterie i archaea wyewoluowały jako adaptacyjna obrona przed egzogennym DNA. Niedawna identyfikacja wielu innych, wcześniej niescharakteryzowanych systemów antyfagowych może dostarczyć kolejnych przełomowych technologii dla zastosowań SB.45 W tym kontekście historycznym jest więc właściwe, że SB jest obecnie stosowana do fagów, aby udoskonalić ich wykorzystanie jako środków terapeutycznych.
Fagi zostały odkryte niezależnie przez Frederika Tworta i Félixa D’Hérelle’a na początku XX wieku46,47 i wkrótce potem wykorzystywane jako środki przeciwdrobnoustrojowe do leczenia chorób zakaźnych, takich jak cholera i dżuma. W Europie Wschodniej terapia fagowa stała się powszechna i do dziś istnieje kilka renomowanych ośrodków leczniczych, np. w Gruzji i Polsce. Na Zachodzie, po sporadycznych początkowych sukcesach, terapia fagowa przestała być stosowana, ponieważ antybiotyki stały się powszechnie dostępne. Obecnie, wraz z pojawieniem się patogenów opornych na środki przeciwdrobnoustrojowe, początkowo tak zwanych szczepów ESKAPE48 , a obecnie jeszcze szerszego zestawu patogenów49 , które według przewidywań do 2050 roku będą powodować więcej zgonów niż nowotwory, nastąpił ponowny wzrost zainteresowania terapią fagową.
Użycie fagów ma kilka zalet w porównaniu z antybiotykami, przede wszystkim możliwość ukierunkowania na określone szczepy i tym samym pozostawienie korzystnej społeczności mikrobiologicznej nienaruszonej, a także możliwość pokonania oporności poprzez zastosowanie uzupełniających koktajli fagowych, „trenowanie” fagów na wybranych szczepach gospodarza lub po prostu wyizolowanie nowych fagów przeciwko patogenowi. Z drugiej strony istnieje kilka przeszkód do pokonania i obszarów do poprawy, aby terapia fagowa stała się wiarygodnym lekiem i została szeroko przyjęta na Zachodzie, takich jak: silne badania kliniczne z właściwą kontrolą, skrócenie czasu identyfikacji fagów z odpowiednim zakresem gospodarza, przezwyciężenie oporności fagów i mechanizmy wykluczania szczepu docelowego bez potrzeby stosowania złożonych koktajli, obejście niepożądanych odpowiedzi immunologicznych na cząstki fagowe i ograniczenie uogólnionej transdukcji genów oporności na antybiotyki lub czynników wirulencji bakterii. Nawet w przypadku skutecznego zabicia szczepu docelowego, szybka liza dużej liczby bakterii i jednoczesne uwolnienie endotoksyn i superantygenów może spowodować silną odpowiedź zapalną i niekorzystny wynik kliniczny.
Wysoce modułowa organizacja genomów fagowych i składanie struktury fagowej jako funkcjonalnych modułów, takich jak włókna ogonowe, kolce, rurki ogonowe i kapsyd, czyni fagi idealnymi celami dla podejść SB, w pewnym sensie genomy fagowe są już zorganizowane w BioBricks. We wczesnym wzorcu dla przyszłych fagów syntetycznych fag filamentowy Pf3 został zmodyfikowany w celu leczenia infekcji Pseudomonas aeruginosa w modelu mysim.50 Gen białka eksportowego faga Pf3 zastąpiono genem kodującym endonukleazę restrykcyjną BglII, przy założeniu, że (1) ta zamiana genów powoduje, że Pf3 nie replikuje się, wprowadzając w ten sposób strategię powstrzymywania, (2) fag może być stabilnie namnażany w gospodarzu zawierającym gen metylazy BglII i (3) BglII będzie katalizował pęknięcia podwójnej nici w genomowym DNA szczepu docelowego do zabijania. Ważnym odkryciem tego badania było to, że leczenie zakażonych myszy fagiem Pf3R lub fagiem litycznym dawało porównywalną przeżywalność dla myszy zakażonych minimalną dawką śmiertelną 3, ale przy minimalnej dawce śmiertelnej 5 przeżywalność była znacznie lepsza w przypadku terapii fagiem Pf3R. Analiza poziomów cytokin w surowicy wykazała zmniejszoną odpowiedź zapalną wskazującą, że lepszy wynik dla grupy leczonej Pf3R jest spowodowany skutecznym zabijaniem szczepu docelowego bez lizy i uwalniania endotoksyny.
Zabijanie P. aeruginosa przez Pf3R opiera się na zakresie gospodarza faga, aby zapewnić specyficzność celowania, ponieważ oczekuje się, że miejsca restrykcyjne BglII będą obecne w zasadzie we wszystkich genomach bakterii. Poprawa sytuacji jest sugerowana przez niezwykłe odkrycie bakteriofaga, który uzyskał system CRISPR/Cas, z nieznanego źródła, na własny użytek.51 Zakodowany przez faga system CRISPR/Cas jest zdolny do zdobywania nowych odstępów, a nukleaza CAS3 została ponownie skierowana do elementu chromosomalnego, który jego gospodarz, Vibrio cholera, wykorzystuje do odporności wrodzonej. W następstwie tego odkrycia system CRISPR typu II ze Streptococcus pyogenes został wprowadzony do bakteriofaga M13 wraz z odstępnikami w celu ukierunkowania sekwencji na oporność na antybiotyki i geny wirulencji u Escherichia coli, przy czym autorzy nazwali te urządzenia RNA-guided nucleases (RGNs).52 Demonstrując wyjątkową specyficzność tego systemu, RGN był w stanie dyskryminacyjnie zabić szczep posiadający polimorfizm pojedynczego nukleotydu w gyrazie DNA, który nadaje oporność na chinolony. Co więcej, w sztucznym konsorcjum trzech szczepów bakterii były one w stanie zabić wybrane szczepy (400-20,000 razy w porównaniu do kontroli), pozostawiając innych członków konsorcjum nietkniętych. Specyficzność CRISPR/Cas-mediated zabijania może rozszerzyć terapii fagowej poza celowanie patogenów do precyzyjnej modulacji ludzkiego mikrobiomu, którego skład został implikowany w prognozie dla niektórych nowotworów, a nawet zaburzeń neurologicznych, takich jak autyzm, Parkinsons i Alzheimera przez oś jelitowo-mózgową.
Idealna syntetyczna platforma fagowa może być taka, w której wiązanie zakresu gospodarza jest zaprojektowany, aby być bardzo szeroki, podczas gdy specyficzność szczepu docelowego jest dostarczana przez CRISPR/Cas payload. W ten sposób fag może być łatwo rozmieszczone do leczenia, bez nowej platformy muszą być izolowane ad hoc dla każdego patogenu. Ponadto, szeroki zakres gospodarza w połączeniu z matrycami CRISPR ukierunkowanymi na kilka genów oporności na antybiotyki lub wirulencji może pozwolić na zastosowanie wstępnej terapii fagowej, to znaczy przed identyfikacją patogenu. Strategie rozszerzania zakresu gospodarza obejmują badania genetyczne w celu identyfikacji receptorów fagowych i wymaganych czynników gospodarza,53 wydobywanie sekwencji białek wiążących receptory (RBP) z genomów bakteryjnych i restartowanie syntetycznych fagów, które mogłyby, na przykład, kodować biblioteki białek wiążących receptory RBP dla HTS.54,55 Maskowanie receptorów przez kapsuły może być przezwyciężone przez ekspresję enzymów hydrolizujących egzopolisacharydy56 i innych enzymów degradujących biofilmy57 , podczas gdy inne mechanizmy maskowania i zmienność fazowa w ekspresji receptorów mogą być przezwyciężone przez fagi zmodyfikowane z kilkoma włóknami ogonowymi zawierającymi różne RBP lub RBP do niekanonicznych, wysoce konserwatywnych celów na powierzchni komórki. Bakterie stosują liczne systemy antyfagowe, z których główne to wrodzona odporność na modyfikację restrykcyjną i adaptacyjna odporność CRISPR/CAS, ale odwrotnie, fagi rozwinęły wiele strategii, aby pokonać te systemy, takie jak stosowanie niekanonicznych nukleotydów w ich DNA, posiadanie mniejszej liczby miejsc restrykcyjnych lub nadmierna metylacja ich genomów i dostarczanie białek, które hamują enzymy restrykcyjne lub wzmacniają enzymy metylujące gospodarza.
W ciągu ostatniej dekady z odnowionego zainteresowania terapii fagowej i sporadyczne doniesienia o udanych indywidualnych przypadkach pacjentów zostały próby prowadzenia kontrolowanych badań klinicznych, które doprowadziły do braku znaczących działań niepożądanych, ale skuteczność nadal nie wykazano zdecydowanie. To będzie ekscytujące następny artykuł z historii terapii fagowej, która rozpoczęła się ponad 100 lat temu, aby zobaczyć SB inżynierii fag wprowadzić badania kliniczne.
.