Badanie Minimalnego Stężenia Inhibicyjnego (MIC) i Minimalnego Stężenia Bakteriobójczego (MBC) definiuje siłę działania badanego materiału w kategoriach stężenia, przy którym będzie on hamował wzrost (Minimalne Stężenie Inhibicyjne, (MIC) lub całkowicie zabije (Minimalne Stężenie Bakteriobójcze (MBC)) 1 x 106 (milion) mikroorganizmów podczas 18-20-godzinnego okresu ekspozycji w inkubatorze (35 ± 2°C).
Metoda MIC mierzy efekt zmniejszających się stężeń środka antyseptycznego w określonym czasie pod względem zahamowania wzrostu populacji drobnoustrojów. Stężenie leku wymagane do wywołania efektu jest określane jako Minimalne Stężenie Inhibicyjne i jest zwykle kilkaset do tysięcy razy mniejsze niż stężenie występujące w gotowej postaci dawki.
Methods For Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests For Bacteria That Grow Aerobically
Standardowym odniesieniem stosowanym jako podstawa do wykonania oznaczenia minimalnego stężenia hamującego (MIC) jest najbardziej aktualna wersja Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically (obecnie, CLSI Doc. M7-A9, Clinical Laboratory Standards Institute) lub beztlenowych (CLSI Doc. M11-A8).
MIC &Przegląd testu MBC
Produkt jest seryjnie rozcieńczany w stosunku 1:2 w podłożu odpowiednim do wzrostu każdego mikroorganizmu, zwykle Mueller-Hinton Broth (MHB) lub Mueller-Hinton Agar (MHA), w celu uzyskania serii rozcieńczeń produktu w podłożu do 1:32,768 (zgodnie z BSLI SOP L-2045). Jednakże, w zależności od rodzaju produktu, seria rozcieńczeń może nie być wykonywana tak daleko. Do probówek w serii, z których każda zawiera 2,0 mL podwielokrotności produktu seryjnie rozcieńczonego w podłożu wzrostowym, dodaje się 1,0 mL zawiesiny 1 x 106 CFU/mL gatunku prowokującego. Po 18-24 godzinach inkubowanej ekspozycji, probówki zawierające zawiesinę prowokowanego drobnoustroju/produktu/podłoża są badane w celu określenia najwyższego rozcieńczenia produktu (i odwrotnie, najniższego stężenia produktu), które całkowicie hamuje wzrost drobnoustroju, co można stwierdzić gołym okiem. Ta wartość rozcieńczenia (i/lub wartość stężenia produktu) jest zapisywana jako wartość Minimalnego Stężenia Inhibicyjnego.
Jeżeli pożądane jest oznaczenie MBC, odmierzone ilości przenosi się z zawiesiny rozcieńczającej, która reprezentuje minimalne stężenie hamujące, oraz z dwóch lub trzech zawiesin rozcieńczających poprzedzających rozcieńczenie minimalnego stężenia hamującego, na płytki ze stałym podłożem wzrostu, które następnie inkubuje się przez 24 godziny w temperaturze 37E± 2E. Po inkubacji płytki są badane pod kątem wzrostu drobnoustroju. To rozcieńczenie produktu (i/lub stężenie produktu), które nie powoduje wzrostu, jest zapisywane jako MBC. Należy pamiętać, że procedury badania MIC/MBC można przeprowadzać, stosując seryjne rozcieńczenia produktu w stosunku 1:2 w pożywce agarowej (badanie w fazie stałej) lub seryjne rozcieńczenia produktu w stosunku 1:2 w pożywce bulionowej (badanie w fazie zawiesiny). O ile Sponsor nie wymaga wyraźnie metody rozcieńczenia w agarze, BSLI wykona badanie MIC metodą rozcieńczenia w bulionie z makrotubą, ponieważ jest ona znacznie mniej materiało- i czasochłonna.
Produkty badane w ramach badania nowego leku
W przypadku produktów, które muszą być badane w ramach IND, FDA wyraźnie określa na stronie 31444 TFM, jakie drobnoustroje muszą być używane do zakwestionowania produktów in vitro. For the Minimum Inhibitory Concentration study, the TFM states that the finished product, the product active principal, and the product vehicle must each be challenged with 25 ATCC strains and 25 fresh clinically isolated strains of each the 12 Gram-negative and 11 Gram-positive bacterial species and the two yeast groups of species (Candida albicans and Candida spp., not albicans). Jest to zatem bardzo duże badanie, które obejmuje przetestowanie 1250 szczepów wszystkich 25 bakterii i drożdży określonych w TFM w porównaniu z każdą z trzech konfiguracji produktu.
W ostatnich latach, FDA wycofała się nieco z tego uciążliwego wymogu – chociaż gotowy produkt musi być badany w stosunku do 1250 szczepów, jak stwierdzono, produkt aktywny główny i nośnik produktu muszą być kwestionowane tylko z pięcioma szczepami ATCC i pięcioma świeżymi klinicznie wyizolowanymi szczepami każdego z 25 gatunków bakterii/drożdży. Mimo to, daje to w sumie 250 szczepów, które muszą być badane zarówno dla substancji czynnej, jak i nośnika, a ogólne badanie TFM MIC jest dość masywne i kosztowne – w sumie 1750 indywidualnych oznaczeń minimalnego stężenia hamującego. FDA zezwala również na pewne substytucje gatunkowe (np. gatunki Bacteroides inne niż B. fragilis i gatunki koagulazoujemnych Staphylococcus inne niż S. epidermidis, S. hominis, S. haemolyticus i S. saprophyticus) w celu dostosowania się do niedostatku szczepów ATCC i/lub klinicznych izolatów niektórych gatunków wymaganych przez TFM. A uznając, że ogólnie alkohole nie są aktywne przeciwdrobnoustrojowo po około dwóch rozcieńczeniach w stosunku 1:2, FDA nie wymaga danych MIC dla produktów, w których alkohol jest jedynym aktywnym składnikiem.
MIC & MBC Proof of Concept w celach marketingowych
Ale BSLI przeprowadziła kilka pełnych badań minimalnego stężenia hamującego wymaganych przez TFM dla produktów zarejestrowanych w IND, większość badań minimalnego stężenia hamującego i sporadycznych badań MBC przeprowadza się dla celów proof-of-concept i marketingowych. W tego rodzaju badaniach BSLI generalnie zaleca klientom, aby badane były szczepy ATCC wszystkich 25 gatunków/szczepów wymienionych w TFM oraz izolaty kliniczne każdego z nich (tj. łącznie 50 szczepów prowokujących).
.