Niekompetycyjny inhibitor jest inhibitorem, który wiąże się tylko z kompleksem enzym-substrat. Miejsce jego wiązania tworzy się dopiero wtedy, gdy enzym i substrat wejdą w interakcję między sobą. Niekompetytywna inhibicja nie działa w przypadku próby zaangażowania dodatkowych substratów. Kompleks enzym-substrat-inhibitor nie wytwarza żadnego produktu
E + S -> ES
ES + I -> ESI -X-.> E + P
Inhibitor niekompetycyjny wiąże się z kompleksem enzym-substrat, aby powstrzymać enzym przed reakcją z substratem w celu utworzenia produktu, jako taki, działa dobrze przy wyższych stężeniach substratu i enzymu, że substraty są związane z enzymami; wiązanie skutkuje zmniejszeniem stężenia substratu wiążącego się z enzymem, Km i Vmax oraz zwiększeniem powinowactwa wiązania enzymu do substratu.
E + I -> (przez S) ES + I -> E + P
gdzie E jest enzymem, I jest inhibitorem, ES jest kompleksem enzym-substrat, a P jest produktem.
To wiązanie substratu modyfikuje strukturę enzymu, czyniąc miejsce wiązania inhibitora dostępnym. Niekompetycyjna inhibicja obniża maksymalną prędkość, jak również KM. K,M jest stężeniem substratu, gdy prędkość jest połową prędkości maksymalnej w oparciu o model kinetyki Michaelisa-Mentena. Zarówno Vmax jak i KM są zmniejszone o równe wartości. Vmax będzie nadal zmniejszone, mimo że wiązanie enzym-substrat jest zwiększone, ponieważ tworzą się kompleksy ESI. Kompleksy ESI hamują powstawanie produktu. Niekompetycyjny inhibitor obniży KM i stworzy lepsze wiązanie enzym-substrat, ponieważ wiąże się tylko z kompleksem ES. Jednak kompleks ES jest stale uszczuplany w miarę wiązania się inhibitora, co powoduje powstawanie kompleksów ESI. Dlatego, aby utrzymać równowagę pomiędzy kompleksami ES i ESI i zgodnie z zasadą Le Chateliera, reakcja przesuwa się w kierunku tworzenia większej ilości ES, gdzie będzie wiązać więcej substratu do enzymów, aby stworzyć więcej ES. Ostatecznie, prowadzi to do obniżenia KM. Zmniejszona KM wskazuje na lepsze wiązanie enzym-substrat, ponieważ enzym może osiągnąć połowę swojej maksymalnej prędkości przy mniejszym stężeniu substratu. W pewnym sensie, wiązanie enzym-substrat jest bardzo wydajne, ponieważ enzym i substrat mają wysokie powinowactwo i silnie oddziałują.