Śmierć komórki jest kluczowa dla prawidłowego wykonywania normalnych i patofizjologicznych procesów i jest wszechobecna w systemach biologicznych.

Programowane formy śmierci komórkowej są odpowiedzialne za wytwarzanie wzorców morfologicznych podczas rozwoju, negatywną selekcję podczas odporności oraz molekularny „wyścig zbrojeń”, który zachodzi pomiędzy genami wirusów i gospodarzy podczas infekcji, jak również za uszkodzenia tkanek, które występują w przypadku stresorów środowiskowych, takich jak genotoksyny.

Alteracje w obrębie tych szlaków śmierci komórkowej mogą przejawiać się jako choroba, w tym rak, zaburzenia degeneracyjne i zespół nabytego niedoboru odporności (AIDS). Zdolność komórek nowotworowych do unikania zaprogramowanej śmierci komórki jest cechą charakterystyczną większości typów raka.

W ostatnich latach stało się jasne, że samo mierzenie poszczególnych cech umierających komórek, takich jak fragmentacja jądra lub przepuszczalność błony, nie jest wystarczające do rozróżnienia różnych ścieżek śmierci komórki, które obejmują apoptozę, autofagiczną śmierć komórki i martwicę.

Wymagana jest wieloparametrowa ocena śmierci komórki, która ujawnia mechanistyczne zdarzenia zachodzące „za kulisami”. Zgodnie z zaleceniami Nomenclature Committee on Cell Death 2009, procesy związane ze śmiercią komórki (apoptoza, nekroza, autofagia) mogą być klasyfikowane według wyglądu morfologicznego, kryteriów enzymologicznych, aspektów funkcjonalnych i cech immunologicznych.

Śmierć komórki w różnych formach

Apoptoza

Apoptoza odnosi się do kierowanego przez geny programu samobójstwa komórki. Wiele różnych białek komórkowych, w tym receptory na powierzchni komórki, proteazy i składniki mitochondrialne, regulują delikatną równowagę między przeżyciem komórki a śmiercią przez apoptozę. Mutacje w obrębie tych białek mogą naruszyć tę równowagę, powodując niekontrolowane przeżycie i proliferację komórek nowotworowych. Dlatego też, odkrycie mechanizmów apoptozy może zaowocować nowymi strategiami wykorzystania tej formy śmierci komórki do celów terapeutycznych.

Apoptozie towarzyszy zmniejszenie objętości komórki, kondensacja jądrowa, fragmentacja DNA, rozerwanie błony plazmatycznej i pochłanianie przez fagocyty. Dodatkowo, apoptoza zazwyczaj obejmuje permeabilizację błony mitochondrialnej, po której następuje aktywacja kaskady kaspaz; jednakże proteazy nie będące kaspazami mogą być alternatywnie aktywowane.

Nekroza

Nekroza była historycznie uważana za pasywną formę śmierci komórki. Jednak ostatnie dane sugerują, że nekroza może być również alternatywną formą zaprogramowanej śmierci komórki, której aktywacja może mieć ważne konsekwencje, takie jak indukowanie odpowiedzi zapalnej. Nekroza i apoptoza różnią się od siebie morfologicznie. Nekrozie towarzyszy zwiększenie objętości komórki, pęcznienie organelli, pęknięcie błony plazmatycznej i utrata zawartości wewnątrzkomórkowej.

W odniesieniu do różnicy między apoptozą a nekrozą, różne metody rozróżniania między apoptotyczną a nekrotyczną śmiercią komórki opierają się na charakterystycznych cechach, które mogą być wizualizowane i/lub mierzone, takich jak rozmiar komórki, fragmentacja komórki i rozszczepienie DNA.

Autofagia

Autofagia jest wysoce regulowanym homeostatycznym procesem degradacyjnym, w którym komórki niszczą swoje własne składniki za pośrednictwem mechanizmów lizosomalnych i poddają je recyklingowi. Proces ten jest związany z różnymi chorobami, w tym z chorobą Alzheimera, starzeniem się, nowotworami i chorobą Crohna. W niektórych przypadkach podwyższony poziom autofagii przyczynia się do śmierci komórek poprzez intensywne współdziałanie z proapoptotycznymi szlakami sygnalizacyjnymi. Zrozumienie korelacji między autofagią a apoptotyczną śmiercią komórek jest przedmiotem wielu badań, szczególnie w biologii nowotworów.

Autofagia vs Apoptoza

Autofagiczna śmierć komórki jest morfologicznie definiowana jako śmierć komórki, która zachodzi przy braku kondensacji chromatyny, ale towarzyszy jej masywna wakuolizacja cytoplazmy. W przeciwieństwie do apoptozy, autofagia ma niewielki lub żaden związek z fagocytami. Podczas tej formy śmierci komórki, materiał cytoplazmatyczny jest sekwestrowany w autofagosomach w celu degradacji przez lizosomy.

Obecnie wiadomo, że istnieje wzajemne oddziaływanie między szlakami apoptozy i autofagii, a badania wykazały, że BCL2, który jest ważnym regulatorem apoptozy, jest również ważnym regulatorem szlaku autofagii.

Ostatnie postępy w biologii chemicznej, analizie szlaków i wyrafinowanej cytometrii umożliwiły głębszy wgląd w markery molekularne i zmiany komórkowe, które charakteryzują każdy szlak śmierci komórkowej. Co więcej, ewolucja technologii umożliwiła również wykonywanie wielu z tych ocen jako rutynowych eksperymentów na stanowisku badawczym, zgodnie z dalszymi analizami. Razem, te postępy przekształciły badania nad śmiercią komórki w sekcję zniuansowanych sieci sygnalizacyjnych, które są zintegrowane w złożone systemy.

Jedną z kluczowych cech śmierci komórki, którą społeczność naukowa próbuje odkryć, jest punkt bez powrotu wzdłuż tych zniuansowanych ścieżek. Istnieją zarówno odwracalne i nieodwracalne punkty wzdłuż każdego szlaku sygnalizacji śmierci komórki, a określenie, gdzie leży punkt przejściowy w różnych kontekstach, ma ogromne znaczenie z punktu widzenia prób interwencji w proces. Niezależnie od rodzaju śmierci komórki, gdy komórka przekroczy punkt bez powrotu, śmierci nie można zapobiec.

Analiza śmierci komórki

W celu podziału, scharakteryzowania i rozróżnienia różnych form śmierci komórki, potrzebne są dwa rodzaje kryteriów: opisowe (np. obrazowanie) i funkcjonalne (np. hamowanie szlaków). Na przykład, fragmentacja DNA i aktywacja kaspazy mogą pomóc zdefiniować apoptozę, ale te analizy nie są ostateczne, gdy są stosowane w izolacji, ponieważ apoptoza może wystąpić bez fragmentacji DNA, a aktywacja kaspazy jest również związana z innymi procesami biologicznymi.

W związku z tym, śmierć komórek powinna być zawsze mierzona przy użyciu wielu metod, najlepiej w tej samej próbce, łącząc oznaczenia biochemiczne i morfologiczne, jeśli to możliwe. Szereg technologii może dostarczyć cennych informacji na temat różnych ścieżek śmierci komórki, włączając obrazowanie, TUNEL, analizy oparte na immunologii, cytometrię przepływową, cytometrię opartą na obrazowaniu oraz technologie obrazowania komórek przylegających. Jednakże, istnieje kilka wspólnych, nieodłącznych wad obecnych metod badania śmierci komórki, które mogą ograniczać ich użyteczność.

Na przykład, technologie takie jak Western Blotting i ELISA nie są w stanie zapewnić specyficznych zmian per-cell, chociaż są bardzo przydatne do zbierania informacji na temat całkowitej zmiany w procesie. Niektóre metody obrazowania mogą mieć ograniczenia co do tego, czy równoważna liczba komórek jest liczona pomiędzy próbkami, lub czy wystarczająca liczba komórek jest liczona, co może mieć wpływ na odtwarzalność i/lub dokładność wyników.

Na drugim końcu, metody takie jak wieloparametryczna cytometria przepływowa lub cytometria obrazowa mogą być bardzo wydajne i dostarczać bogatych w treść danych do analiz śmierci komórek, ale metody te mogą mieć również ograniczenia. Na przykład, dostęp do oprzyrządowania może być ograniczony, może istnieć wymóg dużej wiedzy specjalistycznej i szkolenia, a przystępność cenowa może być wyzwaniem.

W branży istnieje zapotrzebowanie na łatwe w użyciu, niedrogie, dostępne metodologie, które mogą w sposób solidny, dokładny i powtarzalny dostarczyć odpowiedzi na powszechne, codzienne pytania, które naukowcy badają w zakresie zdrowia i śmierci komórek. Poniżej opisano ugruntowane i powstające metody skutecznego rozróżniania apoptozy, nekrozy i autofagii.

Obrazowanie

Śmierć komórki jest ostatecznie procesem morfologicznym, a złotym standardem analizy tego procesu jest wizualizacja komórek. Kiedy śmierć komórki jest obserwowana w hodowli, staje się bardzo oczywiste, co się dzieje. Na przykład, podczas apoptozy, komórki zaokrąglają się i wydają się gotować („blebbing”). Istnieje wiele metod obrazowania śmierci komórek, w tym po prostu wizualizacja komórek w czasie rzeczywistym w hodowli, barwienie komórek oranżem akrydynowym (istotny barwnik specyficzny dla komórek apoptotycznych), barwienie histologiczne utrwalonej tkanki i mikroskopia elektronowa. Istnieją również nowe opcje dostępne w cytometrii obrazowej, jak opisano dalej.

Terminal Deoxynucleotidal Transferase dUTP Nick End Labeling (TUNEL)

Procedura Terminal Deoxynucleotidal Transferase dUTP Nick End Labeling (TUNEL) jest bardzo powszechną metodą badania fragmentacji DNA, która wynika z apoptozy. TUNEL znakuje końcowe końce DNA, które są rozszczepiane w regionie odstępu między nukleosomami w chromatynie, a te pęknięcia nici DNA są wizualizowane w mikroskopie świetlnym. Chociaż TUNEL jest bardzo skutecznym testem apoptozy, jednym z głównych ograniczeń tego podejścia jest to, że TUNEL wykrywa komórki apoptotyczne na ostatnim etapie procesu.

Aktywacja kaspaz

Na poziomie molekularnym, seria enzymów znanych jako kaspazy są w dużej mierze odpowiedzialne za realizację ścieżki apoptotycznej, ale nie nekrotycznej śmierci komórki. W odpowiedzi na sygnały pro-apoptotyczne, kaspazy uczestniczą w serii reakcji, które prowadzą do rozszczepienia substratów białkowych, powodując rozpad komórki. Kaspazy istnieją w każdej komórce organizmu jako uśpione proenzymy. Podczas apoptozy kaspazy tworzą aktywne enzymatyczne cząsteczki tetramerowe, które mogą aktywować lub inaktywować swoje substraty.

Egzymy te specyficznie rozpoznają sekwencję czterech lub pięciu aminokwasów na docelowym substracie, który zawiera resztę kwasu asparaginowego jako cel do rozszczepienia. Kaspazy funkcjonują w innych procesach biologicznych, takich jak odporność; w rzeczywistości, wiele genomów wirusowych koduje bezpośrednie inhibitory tych kaspaz. Kaspazy mogą być wykrywane poprzez techniki immunoprecypitacji lub immunoblottingu przy użyciu przeciwciał specyficznych dla kaspaz, lub poprzez wykorzystanie substratów fluorochromowych, które stają się fluorescencyjne po rozszczepieniu przez kaspazę. Dodatkowo, udział kaspaz może być uwidoczniony przez traktowanie żywych kultur mimetykiem Smac, bardzo silnym induktorem apoptozy.

Wykrywanie mitochondriów

Mitochondria są kluczowymi regulatorami procesów śmierci komórkowej, takich jak apoptoza. Utrata wewnętrznego potencjału transmembranowego mitochondriów jest często, ale nie zawsze, obserwowana jako związana z wczesnymi etapami apoptozy i uważa się, że odgrywa rolę w niezależnej od kaspaz śmierci komórki. Oznaczenia oparte na fluorescencji przeznaczone do oceny stanu funkcjonalnego mitochondriów są użytecznymi narzędziami do badania roli aktywności mitochondrialnej w kaskadzie apoptozy.

Fosfatydyloseryna i aneksyna V

Fosfatydyloseryna (PS), ograniczona do wewnętrznego listka błony żywych komórek, przenosi się na odsłoniętą powierzchnię błony podczas wczesnych etapów apoptozy. To wydarzenie służy jako sygnał dla komórek fagocytarnych do ataku. PS jest eksponowana głównie na powierzchni blebs komórek apoptotycznych. Aneksyna V ma wysokie powinowactwo do błon zawierających ujemnie naładowane PS. Wydarzenia te mogą być wizualizowane przy użyciu cytometrii przepływowej.

Cytometria przepływowa

Badania cytometrii przepływowej dla apoptozy mają już prawie 25 lat. Najwcześniejsze badania cytometrii przepływowej dla apoptozy analizowały zmiany w rozproszeniu do przodu i do boku oraz fragmentację DNA po leczeniu etanolem. Obecnie badania cytometrii przepływowej obejmują prawie każdy etap apoptozy, od najwcześniejszych zmian mitochondrialnych do aktywacji kaspaz, zmian w błonie i uszkodzeń DNA. W przeciwieństwie do wcześniejszych badań, cytometria przepływowa analizuje apoptozę w pojedynczych komórkach.

Multiparametryczna cytometria przepływowa jest idealnym podejściem do łączenia wielu testów śmierci komórkowej. Wykrywanie kaspaz FLICA, aneksynę V i barwnik trwale wiążący DNA z komórką (np. jodek propidium) można połączyć w potężne, wieloetapowe badanie apoptozy (Rysunek 1).

Połączenie tych badań pozwala na analizę postępu apoptozy i zapewnia znacznie bogatszy obraz niż ten, który może zapewnić jedno badanie.

Stacjonarna platforma cytometrii przepływowej może również natychmiast dostarczyć ilościowych informacji komórkowych dla wielu analiz zdrowia komórek, śmierci komórek, sygnalizacji komórkowej, immunologii i cyklu komórkowego. Jeden z takich instrumentów wykorzystuje zasady cytometrii mikrokapilarnej, która pozwala na analizę małych rozmiarów próbek. Platforma jest zamknięta, przy czym odczynniki i oprogramowanie są ściśle sparowane ze sobą dla dedykowanych zastosowań w celu uproszczenia procesu i zmniejszenia złożoności analitycznej dla wykonywania i uzyskiwania danych opartych na cytometrii.

Technologia ta pozwala na analizę dwóch markerów jednocześnie i może być wykorzystywana do przeprowadzania badań przebiegu czasowego i odpowiedzi na dawkę, zapewniając w ten sposób głębszy wgląd w mechanizmy w grze, jak również bardziej kompleksowy obraz procesu śmierci komórek (rysunek 2).

Do tej pory dostępne jest tylko jedno badanie metodą cytometrii przepływowej do analizy autofagii, które obejmuje pomiar łańcucha lekkiego 3 (LC3). LC3 jest białkiem, które segreguje do autofagosomów, które fagocytują uszkodzone mitochondria i inne organelle wewnątrzkomórkowe, a ostatecznie do lizosomów. Autofagię można wykryć za pomocą cytometrii przepływowej z wykorzystaniem translokacji białka zielonej fluorescencji (GFP)-LC3 (Rysunek 3).

W tym badaniu, linia komórkowa jest trwale transfekowana białkiem GFP-LC3. Podczas indukcji dodaje się inhibitor lizozymu, aby zablokować niszczenie autofagosomów przez lizosomy. Jeśli autofagia występuje, GFP-LC3 będzie gromadził się w autofagach, gdy inhibitor jest obecny i nie będzie uwalniany do mediów. Jeśli autofagia nie zachodzi, to GFP-LC3 będzie gromadził się w cytoplazmie i będzie uwalniany do mediów. GFP-LC3 związany z autofagosomami można wykryć w nienaruszonych komórkach za pomocą cytometrii przepływowej.

Cytometria obrazowa

Cytometria obrazowa pozwala na jednoczesne zbieranie danych cytometrycznych i skorelowanych obrazów komórek, a obecnie istnieje wiele opcji dla tego typu analiz. Ponieważ apoptoza jest wysoce zmienna i plejotropowa, obrazowanie może zapewnić weryfikację, czy apoptoza ma miejsce, a także do pewnego stopnia scharakteryzować proces poprzez wizualizację kondensacji chromatyny i rozpadu cytoszkieletu. Cytometria obrazowa zapewnia również dodatkowe opcje analizy, w tym analizę pixel-by-pixel, które są przydatne w analizie apoptozy. Ponadto nie jest konieczne odłączanie trypsyny lub Accutase® , które mogą „zamulać” etykiety apoptotyczne.

Cytometria obrazowa pozwala również na analizę komórek przylegających bez konieczności usuwania komórek z ich podłoża. Z tego powodu, wiele laboratoriów wykorzystuje cytometrię obrazową do analizy przylegających komórek apoptotycznych. Komórki przylegające, które są odrywane od podłoża, czy to przez zeskrobanie, czy przez trypsynę, mogą zaburzać fenotyp apoptotyczny, a nawet indukować sam proces apoptotyczny. Cytometria obrazowa umożliwia zachowanie przylegających komórek podczas całej analizy poprzez barwienie komórek bezpośrednio na szkiełku komorowym. Ważne jest, aby zauważyć, że przylegające komórki zaokrąglają się po przejściu apoptozy, więc niektóre z komórek, które są w późniejszych etapach apoptozy mogą zostać utracone.

System cytometrii obrazowej oparty na strumieniu zapewnia również bezpośrednią korelację między cytometrią a obrazowaniem, a tym samym łączy analizę cytometryczną i morfologiczną. W systemie obrazowania opartym na strumieniu komórki nie są obrazowane na szkiełku podstawowym; są one raczej obrazowane bezpośrednio w strumieniu. Gdy cytometria i obrazowanie są skorelowane, żywe, wczesne, pośrednie i późne komórki apoptotyczne mogą być grupowane i analizowane (Rysunek 4).

Wniosek – Śmierć komórki: Discriminating between apoptosis, necrosis & autophagy

Śmierć komórki jest naturalnym procesem niezbędnym dla wielu prawidłowych funkcji fizjologicznych zarówno dla rozwoju jak i homeostazy. Ponadto, zmiany w obrębie szlaków sygnalizacyjnych śmierci komórkowej są związane z różnymi chorobami. Pomiar poszczególnych cech charakterystycznych umierających komórek nie jest wystarczający do rozróżnienia różnych szlaków śmierci komórkowej, które obejmują apoptozę, nekrozę i autofagię; zamiast tego potrzebna jest wieloparametrowa ocena, która obejmuje zarówno kryteria opisowe, jak i funkcjonalne.

Ostatnie postępy w technologii umożliwiają obecnie głębszy wgląd w markery molekularne i zmiany komórkowe, które charakteryzują każdy szlak śmierci komórkowej, a także umożliwiły przeprowadzenie wielu z tych analiz jako rutynowych eksperymentów na stanowisku badawczym. DDW

–

Ten artykuł pierwotnie ukazał się w DDW Winter 2014 Issue

–

Dr John Abrams jest profesorem biologii komórki; jego badania badają sieci molekularne in vivo zaangażowane w regulację śmierci komórki i eksplorują determinanty organizacji chromatyny. Dołączył do University of Texas Southwestern Medical Center w 1994 roku i został przewodniczącym programu studiów podyplomowych z genetyki i rozwoju w 2004 roku. Dr Abrams ukończył studia doktoranckie na Uniwersytecie Stanforda.

Dr William G. Telford został pracownikiem naukowym w National Cancer Institute w National Institutes of Health w 1999 roku i jest dyrektorem laboratorium rdzenia cytometrii przepływowej w NCI Experimental Transplantation and Immunology Branch. Otrzymał tytuł doktora mikrobiologii na Michigan State University i ukończył szkolenie podoktorskie w zakresie immunologii w The University of Michigan Medical School.

Louise Rollins jest menedżerem produktu w EMD Millipore Corporation, gdzie wspiera rozwój Muse® Cell Analyzer, zminiaturyzowanego cytometru przepływowego oraz jego specyficznych dla danego zastosowania zestawów testów i modułów oprogramowania do rutynowej analizy zdrowia i śmierci komórek.

.