Properties and Detection of Botulinum Neurotoxin
Clostridia produkują więcej rodzajów toksyn białkowych niż jakikolwiek inny rodzaj mikroorganizmów. Wybitną cechą Clostridium botulinum jest zdolność do syntezy neurotoksyny o niezwykłej sile działania. BoNT należą do rodziny farmakologicznie podobnych toksyn, które wiążą się z obwodowymi synapsami cholinergicznymi i blokują egzocytozę acetylocholiny w połączeniach nerwowo-mięśniowych. BoNT są produkowane w żywności, w jelitach i w hodowlach jako kompleksy toksyn progenitorowych, które składają się z neurotoksyny botulinowej związanej z nietoksycznymi białkami. Wykazano, że nietoksyczne składniki kompleksów nadają neurotoksynie stabilność i zapobiegają inaktywacji przez enzymy trawienne w jelitach.
Diagnoza zatrucia jadem kiełbasianym jest generalnie stawiana na podstawie oceny objawów klinicznych u pacjentów, a w przypadku ognisk choroby przenoszonych przez żywność, na podstawie skupisk przypadków obejmujących grupę osób, które spożyły wspólny pokarm. W większości badań nad botulizmem głównym celem jest wykrycie obecności BoNT, ponieważ przetrwalniki C. botulinum są szeroko rozpowszechnione w środowisku i zanieczyszczają wiele produktów spożywczych. Wykrycie BoNT we krwi, treści żołądkowej i żywności stanowi potwierdzenie zatrucia jadem kiełbasianym. Izolacja C. botulinum z podejrzanej żywności, z kału niemowląt z objawami zatrucia jadem kiełbasianym lub z ran stanowi dowód potwierdzający rozpoznanie zatrucia jadem kiełbasianym. Jednak w większości przypadków nie stanowi to potwierdzenia, ponieważ przetrwalniki znajdują się w żywności i sporadycznie w kale zdrowych dorosłych.
BoNT jest najlepiej wykrywany przy użyciu próby biologicznej toksyny wyekstrahowanej z żywności lub próbki klinicznej. Ekstrakt jest wstrzykiwany dootrzewnowo myszom, a zwierzęta są okresowo obserwowane pod kątem typowych objawów zatrucia jadem kiełbasianym przez okres do czterech dni. W zależności od ilości obecnego BoNT objawy zatrucia jadem kiełbasianym obserwuje się zwykle w ciągu 4-24 h. Charakterystyczne objawy obejmują zmniejszenie ruchliwości zwierząt, zmierzwienie sierści, trudności w oddychaniu, skurcz mięśni brzucha dający morfologię „osy”, a następnie drgawki i śmierć. Zwierzęta wykazujące te objawy zazwyczaj umierają w ciągu 24-48 h. Zwierzęta, które padają wcześniej niż po 2 h lub po 48 h powinny być uważane za padłe w wyniku działania substancji innych niż BoNT. Śmierć spowodowana BoNT jest potwierdzana przez neutralizację antytoksynami specyficznymi dla danego serotypu.
Powikłania są często spotykane w testach biologicznych na myszach, w których BoNT pochodzi z próbek klinicznych i niektórych pokarmów. W szczególności częste są zgony spowodowane przez substancje zakłócające inne niż Botulinum. Tych niespecyficznych przypadków śmiertelnych można na ogół uniknąć poprzez rozcieńczenie zakłócającej substancji śmiertelnej do punktu końcowego, w którym śmierć jest powodowana przez silniejszy BoNT. Sporadycznie, więcej niż jeden serotyp BoNT może być obecny w analizowanej próbce, a potwierdzenie wymaga neutralizacji przez mieszaninę antytoksyn. W przypadku żywności lub próbek klinicznych, zgony niezwiązane z Botulinum mogą wystąpić w wyniku zakażenia lub obecności endotoksyn. Czynniki zakaźne mogą zostać usunięte przez filtrację membranową lub przez dodanie antybiotyków do badanego ekstraktu. Ekstrakty zawierające endotoksyny mogą być generalnie rozcieńczone do właściwego punktu końcowego lub endotoksyny mogą być usunięte przez adsorpcję. W przypadku ekstraktów z nieproteolitycznych szczepów C. botulinum (grupa II) toksyczność zwiększa się po aktywacji przez proteazę, taką jak trypsyna. W niektórych produktach spożywczych trypsyna może generować toksyczne peptydy i dlatego reakcja powinna być zakończona przez dodanie sojowego inhibitora trypsyny po 30-60 min.
Żywotne C. botulinum można wyizolować z żywności przez wzbogacenie w odpowiedniej pożywce wzrostowej, takiej jak bulion z gotowanego mięsa i glukozy lub pożywki zawierające peptony, ekstrakt drożdżowy i glukozę. C. botulinum ma złożone wymagania co do składników odżywczych i wymaga bogatego podłoża do wzrostu. W celu izolacji, często przydatne jest podgrzanie porcji żywności lub próbki klinicznej w temperaturze 80° lub 60°C, aby wyselekcjonować przetrwalniki odpowiednio grupy I i II C. botulinum. Czasami do inaktywacji komórek wegetatywnych w próbkach żywności analizowanych pod kątem obecności C. botulinum grupy II stosuje się 50% etanol. Po wzbogaceniu, obecność BoNT jest oznaczana za pomocą próby biologicznej na myszach, jak opisano wcześniej. Do izolacji grupy I C. botulinum z próbek klinicznych zastosowano podłoża do selektywnej izolacji zawierające antybiotyki, w tym cykloserynę, sulfametoksazol i trimetoprim.
Do wykrywania BoNT opracowano wiele metod immunologicznych, ale większość z nich nie jest tak czuła jak test biologiczny na myszach, a ich potencjalną wadą jest wykrywanie biologicznie nieaktywnego BoNT. W celu złagodzenia tych wad dokonano kilku postępów w zakresie testów immunoenzymatycznych (ELISA) i jest prawdopodobne, że ELISA będzie stosowana jako uzupełnienie, ale nie zastąpienie testu biologicznego na myszach.
.