Poniższe szczegółowe wyjaśnienie testów serologicznych w kierunku celiakii zostało napisane przez Toma Ryana, specjalistę ds. obsługi technicznej, INOVA Diagnostics, Inc.

W ostatnim czasie odbyło się wiele dyskusji na temat testów serologicznych w kierunku celiakii, a w szczególności na temat testów tTG (Transglutaminaza tkankowa). Postaram się odpowiedzieć na niektóre z wielu pytań, które pojawiły się na tej liście na temat wszystkich testów. Po pierwsze, i odnosi się to do każdego z badań krwi, musisz być obecnie na diecie zawierającej gluten, aby badania były dokładne. Przeciwciała są produkowane przez układ odpornościowy w odpowiedzi na substancje, które organizm postrzega jako zagrażające. Odpowiedź immunologiczna, którą wytwarza Twój organizm, jest odpowiedzią na kontakt z glutenem w diecie i jego późniejszy wpływ na błonę śluzową jelita. Jeśli w diecie nie ma glutenu, nie ma żadnej odpowiedzi, którą moglibyśmy zmierzyć. Krótka zmiana w diecie nie będzie miała zauważalnego efektu. Jeśli byłeś bezglutenowy przez tydzień lub dłużej, nie będzie to stanowiło wielkiej różnicy. Reakcja może być nieznacznie mniejsza, ale różnica jest nieistotna, ponieważ organizm nie miał czasu, aby zareagować na zmianę. Odwrotnie, jeśli byłeś bezglutenowy przez dłuższy okres czasu i zdecydujesz się na test, krótkie wyzwanie kilku tygodni nie wystarczy, aby wywołać odpowiedź i uzyskać dokładny test.

Istnieje kilka kroków, które mają miejsce w celu wygenerowania odpowiedzi immunologicznej i potrzeba czasu zarówno na pozytywną reakcję, gdy gluten jest obecny, jak i na oczyszczenie przeciwciał, gdy gluten jest wyeliminowany. Było wiele dyskusji na temat tego, ile i jak długo powinno trwać wyzwanie i nie ma konsensusu. Porozmawiaj ze swoim lekarzem. Moje osobiste odczucie jest takie, że minimum to 2 kromki chleba dziennie przez 6 tygodni, aby uzyskać dokładny test, ale nie próbowałbym zgadywać lekarza. Istnieją w zasadzie cztery testy, które mogą być wykonane, aby pomóc w diagnozowaniu celiakii. Zauważ, że mówię, że będą one pomocne w diagnozowaniu celiakii. Immunologia jest dość dokładna, ale jest daleka od bycia nauką ścisłą. Wszystkie badania laboratoryjne, niezależnie od ich rodzaju i źródła, są przedstawione jako pomoc w diagnozie. Nie powinny być stosowane samodzielnie jako podstawa do postawienia diagnozy, ale raczej powinny być rozważane w połączeniu z fizycznym badaniem pacjenta, jak również zgłoszonymi objawami, itp. przez wyszkolonego lekarza. Było wiele zamieszania wokół tego, czym są testy i mam nadzieję, że uda mi się złagodzić niektóre z nieporozumień. Jest wiele terminów, które słyszymy. tTG, IgA, IgG, ELISA, itd. Czym one wszystkie są? Niektórzy autorzy tej listy odnoszą się do testu IgA lub IgG albo do testu ELISA. Te oznaczenia są niekompletne dla naszych celów i mogą odnosić się do dowolnej liczby różnych testów.

Wszyscy mamy, w naszych ciałach, rodzinę blisko spokrewnionych, choć nie identycznych białek, które są zdolne do działania jako przeciwciała. Są one określane zbiorczo jako immunoglobuliny. Pięć głównych typów immunoglobulin jest normalnie obecnych u dorosłego człowieka. Są to IgG, IgA, IgM, IgE i IgD. Każda z nich jest skróconym sposobem zapisu immunoglobuliny gamma G (lub A, lub M, itd.) i każda z nich pełni inną funkcję w naszym organizmie. IgG jest główną immunoglobuliną w ludzkiej surowicy. Jest ważna dla zapewnienia odporności u rozwijającego się płodu, ponieważ przechodzi przez barierę łożyskową. IgA jest główną immunoglobuliną w wydzielinach błony śluzowej dróg oddechowych i jelit. IgE to globulina gamma produkowana przez komórki wyściełające drogi jelitowe i oddechowe. Wytwarza ona przeciwciała związane z większością reakcji nadwrażliwości (alergicznych). Jest to związane z astmą, katarem siennym, itp. IgM to globulina powstająca w prawie każdej odpowiedzi immunologicznej we wczesnej części reakcji. IgD jest rzadkim białkiem występującym w normalnej surowicy w niewielkiej ilości. Oznaczenia te odnoszą się do typu białka, które jest nośnikiem danego przeciwciała. Wytwarzane są zarówno podtypy IgG jak i IgA przeciwciał antygliadynowych, dlatego też określamy je jako gliadyna IgG lub gliadyna IgA. Wspólnie są to przeciwciała antygliadynowe.

Przeciwciała antygliadynowe:

Obie przeciwciała antygliadynowe IgA i IgG (AGA) są wykrywane w surowicy pacjentów z enteropatią wrażliwą na gluten (celiakia). Przeciwciała antygliadynowe IgG są bardziej czułe, ale są mniej specyficznymi markerami choroby w porównaniu z przeciwciałami klasy IgA. Przeciwciała antygliadynowe IgA są mniej czułe, ale bardziej specyficzne. W badaniach klinicznych przeciwciała IgA mają swoistość 97%, ale czułość wynosi tylko 71%. Oznacza to, że jeśli pacjent jest IgA pozytywny, istnieje 97% prawdopodobieństwo, że ma celiakię. I odwrotnie, jeśli pacjent jest IgA negatywny, istnieje tylko 71% prawdopodobieństwo, że pacjent jest rzeczywiście negatywny pod względem celiakii. Dlatego wynik pozytywny jest silnym wskazaniem, że pacjent ma chorobę, ale wynik negatywny nie musi oznaczać, że jej nie ma. Fałszywie pozytywne wyniki są raczej rzadkie, ale mogą wystąpić wyniki fałszywie negatywne. Z drugiej strony, przeciwciała IgG antygliadynowe są w 91% specyficzne i mają 87% czułości. Oznacza to, że będą one częściej wykazywać wyniki pozytywne, ale nie ma tak silnej korelacji z celiakią. Jest to mniej specyficzne. Pacjenci z innymi schorzeniami, ale nie dotknięci celiakią, będą sporadycznie wykazywać pozytywne wyniki. Przeciwciała IgG antygliadynowe są wykrywalne u około 21% pacjentów z innymi zaburzeniami żołądkowo-jelitowymi. Ten test może dawać wyniki fałszywie pozytywne, ale jest mniej prawdopodobne, że będzie dawał wyniki fałszywie negatywne.

Czuły protokół testowania obejmuje testowanie zarówno przeciwciał IgA, jak i IgG przeciwkogliadynowych, ponieważ znaczna część pacjentów z celiakią (około 2-5%) ma niedobór IgA. Ten połączony test na obecność przeciwciał IgA i IgG antygliadynowych ma ogólną czułość 95% i swoistość 90%. Rodzaj testu używanego do wykrywania przeciwciał antygliadynowych nazywany jest ELISA. Jest to akronim oznaczający Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay. ELISA nie jest testem samym w sobie. Jest to metoda testowania i jest to test stosunkowo prosty do wykonania. Polega ona na umieszczeniu odmierzonej ilości rozcieńczonej surowicy pacjenta w studzienkach specjalnie skonstruowanej i przygotowanej płytki i inkubowaniu jej przez pewien czas z różnymi substancjami chemicznymi. Wynikiem końcowym jest zmiana koloru, której intensywność zależy od stężenia przeciwciał antygliadynowych (lub innego mierzonego białka) w surowicy pacjenta. Zdolność tego zabarwionego roztworu do absorbowania światła o określonej długości fali może być mierzona na urządzeniu laboratoryjnym i porównywana matematycznie z roztworami, które zawierają znaną ilość przeciwciał antygliadynowych, aby uzyskać liczbę określającą ilość obecnego przeciwciała. Próbka może być wtedy sklasyfikowana jako ujemna (0-20 jednostek); słabo dodatnia (21-30 jednostek); lub umiarkowanie lub silnie dodatnia, jeśli jest większa niż 30 jednostek. Celem badania na obecność przeciwciał antygliadynowych jest, oprócz diagnozy enteropatii wrażliwej na gluten, monitorowanie przestrzegania diety bezglutenowej. Poziom przeciwciał IgA przeciwko gliadynie szybko wzrasta w odpowiedzi na gluten w diecie i szybko spada, gdy gluten jest nieobecny w diecie. Przeciwciała antygliadynowe IgA mogą całkowicie zniknąć w ciągu 2-6 miesięcy stosowania diety bezglutenowej, dlatego są przydatne jako kontrola diety. Natomiast przeciwciała antygliadynowe IgG potrzebują dużo czasu, czasami ponad rok, aby stać się ujemnymi. Odwrotna sytuacja jest również prawdziwa. Oznacza to, że pacjent z celiakią, który był na diecie bezglutenowej i ma negatywne wyniki badań na obecność przeciwciał IgA przeciwko gliadynie, wykaże szybki wzrost produkcji przeciwciał, gdy zostanie zakwestionowany przez gluten w diecie. Około 90% zakwestionowanych pacjentów daje pozytywny wynik IgA antygliadynowy w ciągu 14-35 dni po zakwestionowaniu. Przeciwciała IgG są nieco wolniejsze.

Przeciwciała antyendomysialne:

Przeciwciała antyendomysialne klasy IgA (AEA) są bardzo specyficzne, występują tylko w celiakii i DH. Przeciwciała te stwierdza się u około 80% pacjentów z DH i zasadniczo u 100% pacjentów z aktywną celiakią. Przeciwciała IgA przeciwko endomysium są bardziej czułe i specyficzne niż przeciwciała przeciwko gliadynie w diagnostyce celiakii. Miana przeciwciał (rozcieńczenia) są równoległe do zmian morfologicznych w jelicie czczym i mogą być również wykorzystywane do odzwierciedlenia zgodności z dietą bezglutenową. Miana zmniejszają się lub stają się ujemne u pacjentów na diecie bezglutenowej i pojawiają się ponownie po wyzwaniu glutenem.

Test na przeciwciała antyendomysialne jest bardziej subiektywny i bardziej skomplikowany do wykonania przez laboratorium niż testy antygliadynowe. Polega on na seryjnym rozcieńczaniu surowicy pacjenta, to jest rozcieńczaniu jej o ½, następnie ¼, 1/8, 1/16, itd. i umieszczaniu tych rozcieńczeń na szklanym szkiełku, do którego przymocowana jest jakaś tkanka. Szkiełko jest następnie traktowane różnymi roztworami i badane pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu ustalenia, czy surowica wiąże się z którymś z białek w tkance. Jeśli tak, wówczas potwierdza się, że dany pacjent ma przeciwciała na to konkretne białko. Ta metoda testowania nazywana jest IFA lub czasami IIFA. Jest to skrót od Indirect Immuno-Fluorescent Assay (pośrednia próba immunofluorescencyjna). Wybór szkiełka tkankowego, które ma być użyte, zależy od tego, jakiego konkretnego białka, a więc jakiego przeciwciała, konkretnie poszukujemy. Przeciwciała endomysialne reagują z endomysium, które jest otoczką z siateczkowych fibryli otaczających każde włókno mięśniowe. Dlatego, aby wykryć przeciwciała endomysialne, należy użyć substratu tkankowego, który zawiera dużo tkanki mięśniowej. Podłożem używanym najczęściej do tego testu są dystalne odcinki przełyku. Są one bardzo cienko pokrojone i przytwierdzone do szkiełka. Zawierają one włókna mięśniowe i niewiele więcej, więc jest tam dużo endomysium dostępnego do reakcji z przeciwciałami antyendomysialnymi.

Odczytywanie tego testu polega na oglądaniu zareagowanych slajdów za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego w celu dokonania oznaczenia. Wymaga to wysoko wykwalifikowanego i wyszkolonego oka i, z konieczności, jest nieco subiektywne. Poszukuje się zielonej fluorescencji w endomysium pokrywającym włókna mięśniowe. Test jest podawany jako miano lub końcowe rozcieńczenie, w którym fluorescencja może być nadal wyraźnie widoczna. Jak możesz sobie wyobrazić, jest to bardzo subiektywne. Nie ma standaryzowanych wartości i to od oceny danego technika zależy, jakie jest miano punktu końcowego. Ostatnio (1998) antygen endomysialny, na który skierowane są przeciwciała antyendomysialne, został zidentyfikowany jako enzym sieciujący białka, znany jako transglutaminaza tkankowa (tTG). Umożliwiło to produkcję specyficznego dla antygenu testu ELISA zawierającego tTG jako wiarygodną i obiektywną alternatywę dla tradycyjnych i subiektywnych testów opartych na immunofluorescencji. W badaniach klinicznych wykazano, że korelacja z testem endomysial IFA jest bliska 100%. Jest to test, który został bardzo dobrze przyjęty w społeczności profesjonalistów. Jest to test ELISA, podobnie jak test na obecność przeciwciał antygliadynowych i jako taki nie podlega interpretacji, tak jak IFA. To jest największa zaleta tego nowego testu! Z tym lub jakimkolwiek innym testem ELISA, odpowiedź jest mierzona na urządzeniu, które oblicza ilość światła o określonej długości fali, które jest pochłaniane przez roztwór i drukuje wynik liczbowy. Nie ma szansy na błąd ludzki, który mógłby wpłynąć na wyniki, ponieważ nie ma tu mowy o ocenie. Płytka ELISA, niezależnie od tego, na co testujesz, jest przetwarzana z co najmniej trzema surowicami kontrolnymi (czasami nawet ośmioma) oprócz nieznanej próbki, która jest testowana. Jest to surowica ujemna i co najmniej dwie surowice dodatnie zawierające różne poziomy testowanego przeciwciała. Istnieją szczególne wymagania dotyczące poziomów absorpcji tych trzech kontroli. Oznacza to, że każda z nich ma minimalną lub maksymalną (lub obie) liczbę, która musi być widziana przez urządzenie, aby był to ważny test. Jeśli występują jakiekolwiek odchylenia od tych oczekiwanych liczb, jest to wskazówka, że coś poszło nie tak i wyniki testu są odrzucane, a test powtarzany. Dlatego nie ma możliwości, aby technik podał niedokładne wyniki (zakładając, że prawidłowo rozcieńczył próbkę). Albo test był ważny i można polegać na dokładności wyniku, albo test jest nieważny, a cały wynik odrzucony. Jeśli podczas przetwarzania płytki ELISA popełniono jakikolwiek błąd, spowodowałoby to, że liczby surowic kontrolnych znalazłyby się poza zakresem, a cały wynik testu zostałby odrzucony.

Podsumowując, test ELISA tTG mierzy to samo, co endomysialny test IFA, ale za pomocą metody, która jest bardziej czuła i specyficzna oraz nie podlega interpretacji. Przeciwciała Reticulin klasy IgA występują tylko w celiakii i opryszczkowatym zapaleniu skóry. Przeciwciała te występują u około 60% pacjentów z celiakią i 25% pacjentów z DH. Test ten jest coraz rzadziej stosowany ze względu na ograniczoną użyteczność i dostępność lepszych testów. Jest to test IFA wykonywany na podłożu tkankowym ze wszystkimi towarzyszącymi problemami, które się z tym wiążą. Rozwój wszystkich tych testów surowicy ogromnie uprościł diagnostykę celiakii i poprawił również jej dokładność. Oryginalne kryteria diagnozy według Europejskiego Towarzystwa Gastroenterologii Dziecięcej i Żywienia (ESPGAN) obejmowały rok żmudnych badań z:

• Wstępną pozytywną biopsją jelita;
• 6 miesięcy na diecie bezglutenowej;
• Drugą, negatywną biopsją jelita;
• Próbą prowokacji glutenem przez 6 miesięcy i;
• Trzecią, pozytywną biopsją jelita. Zrewidowane kryteria ESPGAN wymagają dodatnich wyników dwóch testów serologicznych potwierdzonych pojedynczą dodatnią biopsją. W praktyce wielu gastroenterologów wykorzystuje badania serologiczne w połączeniu z kontrolowaną dietą i obrazem klinicznym, aby stworzyć podstawę do diagnozy bez potrzeby wykonywania inwazyjnej procedury.

Pod auspicjami Fundacji Celiakii i innych organizacji, na początku tego roku w Marina Del Rey w Kalifornii zorganizowano profesjonalne sympozjum i warsztaty z udziałem uczestników z Europy i Stanów Zjednoczonych w celu ustalenia standardów raportowania wyników badań. Powinno to jeszcze bardziej usprawnić badania i diagnostykę. Na zakończenie tej konferencji utworzono Komitet Standaryzacji Celiakii w celu zbadania i wydania zaleceń dotyczących standardowej metody raportowania wyników.