Wyobraź sobie, że chciałbyś zasadzić ogródek kwiatowy. Możesz poszukać kwiatów, które idealnie pasują do Twojego otoczenia, choć mogą być drogie i wymagać fachowej opieki. Możesz też wybrać odmiany, które może nie są idealne, ale rosną wszędzie, są niedrogie i nie wymagają zbyt wielu zabiegów pielęgnacyjnych. Podobnie, gdy rozpoczynasz projekt badawczy i musisz zdecydować, czy użyć ludzkich komórek pierwotnych czy nieśmiertelnych linii komórkowych, musisz rozważyć szereg czynników.
Czy chcesz zbudować model hodowli komórkowej, który ściśle reprezentuje sytuację in vivo u człowieka? W tym przypadku, ludzkie komórki pierwotne są lepszym wyborem. Ponadto, jeśli planujesz opublikować swoje wyniki, powinieneś pamiętać, że recenzenci mogą chcieć, abyś potwierdził swoje wyniki w systemie, który jest odpowiedni dla ludzkiej fizjologii. A może chcesz mieć model, z którym łatwo się pracuje i który jest dobrze ugruntowany? W tym przypadku preferowane byłyby nieśmiertelne linie komórkowe, chociaż komórki mogą nie zachowywać się dokładnie tak, jak u ludzi.
Human primary cells: peeking into real life
Human primary cells are isolated directly from tissues and retain the morphological and functional characteristics of their tissue of origin. Na przykład, oryginalna tkanka nowotworowa z raka jelita grubego zachowuje kilka markerów nowotworowych i znane mikroRNA. Dla porównania, linie komórkowe wykazują różnice w ich ekspresji (Pastor et al., 2010).
Komórki pierwotne nie żyją jednak wiecznie. Podlegają procesom senescencji i mają ograniczony potencjał do samoodnowy i różnicowania. Starzejąc się, wykazują zmiany morfologiczne i funkcjonalne, dlatego należy je wykorzystywać we wczesnych pasażach. Cechy genetyczne i wiek dawców są również ważne, ponieważ ich komórki mogą zachowywać się inaczej w tych samych warunkach hodowlanych. Może to być korzystne, gdy badamy jak specyficzne cechy komórek różnią się w całej populacji lub gdy testujemy nowe związki. Z drugiej strony, czy Twoje testy wymagają niskiej wariancji? W takim razie użyj komórek pochodzących od tego samego dawcy. Jedną z zalet ludzkich komórek pierwotnych jest to, że nie musisz polegać na modelach zwierzęcych. Oznacza to, że można uniknąć różnic międzygatunkowych – takich jak w anatomii, szlakach molekularnych i metabolizmie – które mogą wpływać na toksyczność leku i sposób działania.
Jak obchodzić się z komórkami pierwotnymi decyduje o sukcesie
Hodowle ludzkich komórek pierwotnych mogą być inicjowane ze zdrowych komórek lub komórek nowotworowych. Pochodzą one od zdrowych dawców, dawców organów, próbek chirurgicznych, tkanek płodu lub dawców pośmiertnych. Podczas planowania eksperymentów należy pamiętać, że źródło ludzkich komórek pierwotnych jest ograniczone. Oznacza to, że możesz nie być w stanie uzyskać dodatkowego materiału od tego samego dawcy. Ponadto, hodowle pierwotne pochodzące z eksplantatów tkankowych są mieszanką różnych komórek na różnych etapach, więc jeśli chcesz zainicjować bardziej jednorodne hodowle, może być konieczne oczyszczenie określonych typów komórek. Ponieważ komórki pierwotne są bardziej wrażliwe niż linie komórkowe, często wymagają dodatkowych składników odżywczych i czynników wzrostu.
Ponieważ różne typy komórek wymagają różnych mediów do wzrostu i przeżycia, zawsze należy optymalizować warunki hodowli dla każdego typu komórek. Linie komórkowe wymagają wysokiego poziomu surowicy. Jednakże, surowica nie jest standaryzowana i różne partie mogą wykazywać dużą zmienność wielu zawartych w niej substancji. Może to w znacznym stopniu wpłynąć na wyniki badań, a nawet sprawić, że będą one niespójne. W przypadku ludzkich komórek pierwotnych należy pamiętać, że wysoki poziom antybiotyków obniża ich żywotność i wzrost. Gdy komórki osiągną różne etapy hodowli, należy je scharakteryzować i zidentyfikować wszelkie zmiany morfologiczne i funkcjonalne. Jest to istotne dla kontroli jakości. Oczywiście, dobra praktyka hodowli komórkowych wymaga dokumentowania wszystkich informacji niezbędnych do śledzenia materiałów i metod. W ten sposób zapewniasz, że Twój model jest przejrzysty i powtarzalny (Pamies et al., 2018).
Zwalczanie skażenia endotoksynami w hodowlach komórkowych
Zanieczyszczenia zagrażają badaniom hodowli komórkowych. Winowajcami są nie tylko bakterie, grzyby, drożdże i mykoplazmy, problemy sprawiają również endotoksyny. Wpływają one na wzrost i funkcjonowanie komórek zarówno in vitro, jak i in vivo (Ryan i in., 2018). Endotoksyny to lipopolisacharydy pochodzące z błony zewnętrznej większości bakterii gram-ujemnych, które są stabilne nawet w wysokich temperaturach. Endotoksyny często zanieczyszczają sprzęt laboratoryjny, ponieważ wykazują wysokie powinowactwo do materiałów hydrofobowych, takich jak plastik. Źródłem zanieczyszczeń jest woda używana do mycia, pożywki i surowice, dodatki, plastiki laboratoryjne i wyroby szklane. Endotoksyny można wykryć za pomocą testu lizatu amebocytów limulusa (LAL), ponieważ LAL tworzy w ich obecności policzalne skrzepy żelowe.
Różne typy komórek różnie reagują na obecność endotoksyn, a limity endotoksyn powinny być ustalone dla każdego typu komórek w hodowlach in vitro (Nomura i in., 2017). Aby zminimalizować ryzyko skażenia endotoksynami, należy używać certyfikowanych, niepirogennych pożywek, surowic i sprzętu laboratoryjnego oraz sprawdzać wodę używaną w laboratorium, zwłaszcza podczas pracy z wrażliwymi komórkami.
Linie komórkowe: integralna część badań biologicznych
Praca z komórkami pierwotnymi opiera się na dekadach badań z wykorzystaniem linii komórkowych. Od początku XX wieku linie komórkowe dostarczyły naukowcom wspaniałego wglądu w biologiczne procesy zachodzące w ludzkich komórkach. Nieśmiertelne linie komórkowe stały się potężnym narzędziem dla niezliczonych zastosowań, włączając w to testowanie metabolizmu leków i cytotoksyczności, badanie funkcji genów, jak również produkcję szczepionek, przeciwciał i związków biologicznych.
Jak wspomniano, cel twoich badań określa typ kultury komórkowej, której używasz. Naukowcy, którzy zamierzają badać podstawowe procesy biologiczne, manipulować funkcjami komórek, ustanawiać nowe metody lub przeprowadzać wstępne badania przesiewowe, wybierają zwykle unieśmiertelnione linie komórkowe. Dlaczego? Są one efektywne kosztowo, łatwe w obróbce i mogą być przechowywane w kulturach przez dłuższy czas. Linie komórkowe są również łatwe do manipulowania i rozszerzania. (Kaur et al., 2012). Czy badania przesiewowe o dużej wydajności są na porządku dziennym? W tym przypadku nieograniczona podaż materiału również może być zaletą.
Jednakże, nawet jeśli wyniki eksperymentalne uzyskane za pomocą linii komórkowych mogą być jasno zinterpretowane i konsekwentnie porównywane z poprzednimi badaniami, należy pamiętać, że znaczenie fizjologiczne tych badań może nie być zbyt wysokie. Istnieją również ograniczenia co do tego, co można zrobić z liniami komórkowymi. W rzeczywistości, niektóre z nich wykazują jedynie marginalne podobieństwo do oryginalnych komórek pierwotnych, ponieważ seryjne pasażowanie może powodować zmiany w genotypie i fenotypie. Może to prowadzić do powstania zmienionej zawartości genomu i nieprawidłowego profilu ekspresji. Linie komórkowe nie posiadają kluczowych cech morfologicznych lub funkcjonalnych, więc mogą nie być zdolne do indukowania istotnych biomarkerów. Oznacza to, że wyniki uzyskane w laboratorium przy użyciu linii komórkowych nie mogą być w pełni przeniesione na ludzi. W dłuższym okresie czasu nieśmiertelne linie komórkowe mogą również ulec zanieczyszczeniu przez inne komórki lub mikroorganizmy (patrz wpis na blogu: Mycoplasma Contamination – Small Organisms Cause Big Trouble). Dlatego proszę posłuchać tej rady: Przed wykonaniem jakiejkolwiek pracy z liniami komórkowymi zawsze najpierw je waliduj, aby upewnić się, że twoje komórki nie są błędnie zidentyfikowane lub zanieczyszczone (Lorsch et al, 2014).
W skrócie, oprzyj swój wybór ludzkich komórek pierwotnych lub nieśmiertelnych linii komórkowych na swoim celu badawczym. W wielu przypadkach nieśmiertelne linie komórkowe oferują bardzo wartościowy model do wstępnych eksperymentów. Następnie użyj ludzkich komórek pierwotnych, aby zreplikować kluczowe wyniki. To zwiększa przekładalność i sprawia, że twoje wyniki są bardziej istotne dla ludzkiej fizjologii.