Depth of Field

Konsekwencją apertury numerycznej jest to, że odnosi się ona bezpośrednio do Depth Of Field (DOF). Dla danego obiektywu, patrząc na próbkę, istnieje określona płaszczyzna doskonałej ostrości. Głębia ostrości to, jak daleko powyżej i poniżej tej płaszczyzny obiektyw i próbka mogą się znajdować i nadal mieć wszystko w ostrości.

To samo występuje w tradycyjnej fotografii, bardzo mały otwór przysłony zwiększy głębię ostrości. Wyższa apertura numeryczna da wyższą rozdzielczość, ale głębia ostrości stanie się znacznie mniejsza. Istnieje odległość powyżej płaszczyzny próbki i odległość poniżej płaszczyzny próbki, i gdziekolwiek w ich obrębie, istnieje zasadniczo doskonała ostrość. Jak tylko obiektyw i próbka znajdą się poza tą granicą, obraz zaczyna się rozmywać.

To się nazywa głębia ostrości. Wzór na głębię ostrości to:

gdzie:
„n” to współczynnik załamania światła materiału między obiektywem a próbką
λ (lambda) to długość fali światła
NA to apertura numeryczna

W większości przypadków materiałem między obiektywem a próbką jest powietrze, a „n” równa się 1,00. Dla wody, jej współczynnik załamania wynosi 1.33, a specjalistyczny olej immersyjny do mikroskopii wynosi 1.52. Dla obiektywów o małym powiększeniu, takich jak 4X lub nawet 10X, typowa głębia ostrości wynosi plus minus 3 do 5 mikronów. W takim przypadku, jeśli próbka jest bardzo płaska, ogniskowanie może nie być w ogóle wymagane, lub musi nastąpić tylko raz. Ogólnie rzecz biorąc, próbki różnią się grubością i różnią się płaskością, więc ogniskowanie jest wymagane.

Dla 20-krotnego powiększenia, które może być aperturą numeryczną od 0,6 do 0,8, głębia ostrości spada do około plus lub minus 500 nanometrów. Przechodząc do wysokiego powiększenia z immersją olejową przy aperturze numerycznej 1,47, głębia ostrości spada bardzo dramatycznie, A głębia ostrości może być plus lub minus 0,1 do 0,2 mikrona (100 – 200 nm). To bardzo wąska tolerancja. Przy 100 nanometrach lub 200 nanometrach, bardzo małe zmiany płaskości próbki lub jej wysokości, lub precyzji prowadnic w stoliku ruchu XY próbki, utrudniają utrzymanie ostrości. W celu utrzymania ostrości w takiej sytuacji, system ciągłego śledzenia laserowego autofokusa połączony ze stopniem ogniskującym obiektywu o wysokiej przepustowości, takim jak DOF-5, jest idealnym sposobem utrzymania ostrości w tych zastosowaniach o wysokiej aperturze numerycznej i wysokiej rozdzielczości.