Dyskusja

W niniejszym badaniu wykazaliśmy, że MR i GR są obecne w korze nadnerczy szczura. Wykazaliśmy, że zmiana aktywności MR reguluje produkcję aldosteronu w ZG w sposób, który pasuje do mechanizmu ujemnego sprzężenia zwrotnego. Efekt ten jest specyficzny dla MR, ponieważ modulowanie aktywności GR w ZG nie miało wpływu na produkcję aldosteronu. Według naszej wiedzy, po raz pierwszy opisano ekspresję MR i jego rolę w regulacji wydzielania aldosteronu w obrębie kory nadnerczy. W ZF/ZR zaobserwowaliśmy podobną pętlę sprzężenia zwrotnego, gdy farmakologicznie modyfikowaliśmy aktywność GR. Co ciekawe, aktywacja MR również hamowała wydzielanie kortykosteronu w komórkach ZF/ZR. Nasze odkrycia są zgodne z wcześniejszymi badaniami pokazującymi, że nadnerczowa synteza glikokortykoidów może być modulowana przez steroidy syntetyzowane w obrębie kory nadnerczy (Baird i wsp. 1983, Carsia & Malamed 1983, Darbeida & Durand 1987).

MR aktywacja z FLUDRO wywiera negatywny wpływ na produkcję aldosteronu w ZG komórek przygotowanych od szczurów utrzymywanych na obu HS i LS diety, podczas gdy kwas kanrenoinowy, antagonista MR, pozytywnie regulowane steroidogenezę ze wzrostem wydzielania aldosteronu w ZG komórek od szczurów LS karmionych. Zaobserwowaliśmy bardziej wyraźną odpowiedź w grupach LS w porównaniu z grupą HS. Brak wpływu agonisty i antagonisty GR na podstawowe i stymulowane uwalnianie aldosteronu z komórek ZG jest wysoce wskazujący, że regulacyjna pętla sprzężenia zwrotnego jest receptorowo specyficzna.

Jakie może być fizjologiczne i kliniczne znaczenie ultrakrótkiej pętli sprzężenia zwrotnego aldosteronu? Istnieje ścisły związek między produkcją aldosteronu a czynnikami środowiskowymi, np. spożyciem sodu i potasu, postawą ciała, porą dnia i utratą objętości. Od dawna wiadomo, że nieodpowiedni poziom aldosteronu, w stosunku do poziomu tych czynników środowiskowych, prowadzi do różnych chorób sercowo-naczyniowych i metabolicznych u ludzi i innych zwierząt. Dlatego też, krytycznie wrażliwe pętle ujemnego sprzężenia zwrotnego są ważne dla utrzymania prawidłowej homeostazy. Jest to szczególnie istotne w przypadku homeostazy objętościowo-sodowej, ponieważ nawet niewielkie rozregulowanie odpowiedzi na zmiany w spożyciu sodu w środowisku w czasie może prowadzić do istotnych niekorzystnych skutków sercowo-naczyniowych. Te potencjalne konsekwencje są prawdopodobnie powodem istnienia kilku mechanizmów kontrolnych w systemach regulujących homeostazę objętościowo-sodową, np. w układzie renina-angiotensyna, aldosteron, peptydy natriuretyczne, endotelina, wazopresyna i nerki (nerkowy przepływ krwi, kanalik proksymalny, pętla Henlego i kanalik dystalny/kanalik zbiorczy). Te czynniki regulacyjne są kontrolowane, częściowo, przez: (1) „długie” pętle ujemnego sprzężenia zwrotnego, np. pętla ujemnego sprzężenia zwrotnego objętość-renina-angiotensyna-aldosteron; (2) kierunek działania przeciwstawnie działających czynników, np. peptydy natriuretyczne tłumiące wydzielanie aldosteronu oraz (3) ultrakrótkie pętle sprzężenia zwrotnego, np. bezpośrednia supresja uwalniania reniny z aparatu przykłębuszkowego przez interakcję angiotensyny II z receptorem angiotensyny typu 1. Pod pewnymi względami funkcje ultrakrótkich pętli sprzężeń zwrotnych są analogiczne do niemal uniwersalnej koncepcji hamowania funkcji enzymu przez produkt. Równolegle do efektu angiotensyny II, obecne badanie wspiera hipotezę, że istnieje również ultrakrótka pętla sprzężenia zwrotnego, która modyfikuje produkcję aldosteronu w punkcie jego ostatecznej syntezy, wykorzystując poziom aldosteronu i MR. Ten krok jeszcze bardziej udoskonala produkcję aldosteronu, aby zapewnić, że jest on odpowiedni dla środowiska, w którym organizm aktualnie przebywa. Oczywiście, stanowi on również kolejny punkt w tych homeostatycznych mechanizmach objętościowych, w których dysfunkcja może prowadzić do dysfunkcji układu sercowo-naczyniowego i choroby. Dwa doniesienia są potencjalnie istotne dla tych możliwości. W przeciwieństwie do obecnych badań w normalnych komórkach ZG, gdzie RU 486 nie miał wpływu na wydzielanie aldosteronu, w dwóch zmienionych warunkach, pierwotnych komórkach nowotworowych aldosteronu (Burton i wsp. 2011) i otyłych szczurach z nadciśnieniem Zuckera (Clapham & Turner 1997), RU 486 tłumił poziom aldosteronu w osoczu, ale nie poziom kortykosteronu w osoczu. Podobnie jak w obecnym badaniu, RU 486 nie zmienił poziomu aldosteronu u szczurów kontrolnych (Clapham & Turner 1997). Co ciekawe, w komórkach nowotworowych, antagoniści MR nie mieli wpływu na produkcję aldosteronu. Aktywacja MR nie została przeprowadzona. Ponieważ w preparatach komórkowych stwierdzono podobne stężenia aldosteronu i kortyzolu, można przypuszczać, że obecna była domieszka komórkowa lub występował zmieniony typ komórek (Burton i wsp. 2011). Finally, the results of the present study may be applicable to the regulation of steroids outside the adrenal with their likely physiologic and clinical relevance.

How do changes in MR activity modify aldosterone secretion? Wzrost wydzielania kortykosteronu z równoczesną supresją w produkcji aldosteronu sugeruje, że późny szlak biosyntezy aldosteronu jest miejscem regulacji. Ostatni etap syntezy aldosteronu opiera się na aktywności CYP11B2 (syntaza aldosteronu) (Mornet i wsp. 1989). Spadek konwersji kortykosteronu do aldosteronu jest najprawdopodobniej spowodowany zmniejszoną aktywnością CYP11B2, a nie zmianą ekspresji CYP11B2 z powodu krótkiego (1 h) czasu trwania naszych eksperymentów. Nasze odkrycie obniżonych poziomów białka CYP11B2 w warunkach HS i proponowany mechanizm modyfikacji aktywności CYP11B2 przez MR prawdopodobnie odpowiada za osłabienie regulacyjnej pętli sprzężenia zwrotnego na diecie wysokosolnej.

Niskie spożycie sodu jest dobrze znanym stymulatorem wydzielania aldosteronu (Marusic & Mulrow 1967, Aguilera & Catt 1979), a nasze wyniki są zgodne z tymi doniesieniami. Obserwowaliśmy wzrost kortykosteronu w surowicy z dietą o wysokiej zawartości soli. Zgodnie ze wzrostem kortykosteronu w surowicy, izolowane komórki ZF/ZR od szczurów na diecie o wysokiej zawartości soli wykazały wyższe podstawowe wydzielanie kortykosteronu. Mechanizmy, przez które sód diety wpływa na wydzielanie kortykosteronu nie zostały zbadane, chociaż wcześniejsze badania wykazały, że nadnercza szczurów z niedoborem sodu mają zmniejszone wydzielanie kortykosteronu (Eisenstein & Strack 1961). Kortykosteron może być produkowany zarówno przez ZF/ZR jak i ZG, chociaż większość krążącego kortykosteronu pochodzi z ZF/ZR ze względu na ich znacznie większą masę. Jednakże, ponieważ podstawowe uwalnianie kortykosteronu z komórek ZG nie było dotknięte zmianami w spożyciu sodu w diecie, wydedukowaliśmy, że komórki ZF/ZR przyczyniły się do wzrostu kortykosteronu w surowicy z wysokim spożyciem sodu.

Istnienie wewnątrznadnerczowej pętli sprzężenia zwrotnego wywieranego przez glikokortykoidy i GR w celu regulacji produkcji glikokortykoidów jest od dawna sugerowane przez kilka badań in vivo (Peron i wsp. 1960, Hill & Singer 1968) i in vitro (Morrow i wsp. 1967, Carsia & Malamed 1983). Badania te przynoszą sprzeczne wyniki co do tego, czy glukokortykoidy hamują czy stymulują produkcję glukokortykoidów. Kierunek regulacji wydaje się zależeć od zastosowanego modelu doświadczalnego i czasu trwania leczenia. W tym badaniu dostarczamy dowodów na ujemne regulacyjne sprzężenie zwrotne na wydzielanie kortykosteronu zgodne z ustaleniami Carsia & Malameda (1983), chociaż inni badacze zgłosili przeciwne ustalenia (Darbeida & Durand 1987, Li i wsp. 2011, Asser i wsp. 2014). Pomimo dużego dorobku, mechanizmy, za pomocą których glikokortykoidy regulują steroidogenezę, nie są dobrze poznane. Nasze wyniki wskazujące na wyraźne obniżenie sekrecji kortykosteronu tylko w komórkach ZF/ZR stymulowanych ACTH pod wpływem leczenia DEX są zgodne z ustaleniami Latnera i współpracowników (Latner i wsp. 1977), które sugerują, że glikokortykoidy zmniejszają wiązanie ACTH do jego receptora. Ponadto, antagonista glikokortykoidów, RU 486 nie wpływa na podstawowe wydzielanie kortykosteronu, ale stymuluje produkcję kortykosteronu przez ACTH. Dane te wskazują na możliwość, że aktywność GR modyfikuje wrażliwość komórek ZF/ZR na ACTH. Inne prace wykorzystujące dłuższe czasy inkubacji sugerują, że glikokortykoidy hamują syntezę białek i regulują transkrypcję na kilku docelowych genach w korze nadnerczy (Morrow i wsp. 1967, Asser i wsp. 2014). Chociaż to wyjaśnienie wydaje się mało prawdopodobne w naszym badaniu ze względu na czas trwania naszych eksperymentów, nie możemy wykluczyć, że efekty genomowe mogły przyczynić się do naszych obserwacji.

Zaskakującym odkryciem w naszym badaniu było to, że ZF/ZR w przeciwieństwie do ZG nie wykazuje specyficzności receptorowej. Aktywacja GR lub MR może hamować produkcję kortykosteronu w ZF/ZR. Wykazano, że aktywacja MR moduluje produkcję glikokortykoidów, ale efekt ten jest widoczny tylko w mózgu. Stwierdzono, że podawanie fludrokortyzonu u ludzi hamuje stężenie kortyzolu poprzez downregulację osi podwzgórze-przysadka (HPA) (Otte i wsp. 2003, Buckley i wsp. 2007, Lembke i wsp. 2013). Wyraźny wpływ MR w glikokortykoidowej kontroli zwrotnej HPA został dodatkowo wykazany, gdy wykazano, że kwas kanrenoinowy wywiera przeciwstawny wpływ na wydzielanie kortyzolu i ACTH (Arvat i wsp. 2001, Wellhoener i wsp. 2004). Nasze wyniki sugerują, że oprócz aktywności MR centralnie regulującej produkcję glikokortykoidów, może ona również regulować ją lokalnie w nadnerczu, choć regulacja ta najwyraźniej zależy od poziomu spożycia soli. Na obu dietach w odpowiedzi na ACTH, aktywacja MR hamuje produkcję kortykosteronu, ale, z niejasnych powodów, na diecie o niskiej zawartości soli wydaje się zwiększać poziom kortykosteronu. Biorąc pod uwagę, że in vivo nadnerczy przepływ krwi jest od ZG do ZF/ZR, aldosteron może mieć paracrine efekt na produkcji glukokortykoidów z interesujących fizjologicznych i patofizjologicznych implications.

Jednym z ograniczeń badania było to, że zanieczyszczenie między glomerulosa i fasciculata stref potencjalnie może przesłonić zmiany w odpowiedzi na różne bodźce. Uważamy, że jest to mało prawdopodobne w oparciu o brak CYP11B2 w ZF/ZR i dane mikroskopowe, gdzie komórki ZF/ZR i ZG mają wyraźnie różne cechy, wykazały niewiele, jeśli w ogóle, zanieczyszczeń w dwóch preparatach komórkowych. Drugim ograniczeniem jest to, że obecne badanie nie może ocenić względnego znaczenia tych parakrynnych vs klasycznych efektów endokrynnych kontrolujących steroidogenezę nadnerczy. Trzecim ograniczeniem jest to, że nie wiemy, czy kortyzol lub kortykosteron poprzez interakcję z MR może mieć taki sam efekt jak aldosteron. Jednak, jak wspomniano wcześniej, biorąc pod uwagę kierunek przepływu krwi od stref glomerulosa do fasciculata, gdyby taki efekt wystąpił, nie byłby to efekt lokalny, parakrynny. Po czwarte, nie możemy wykluczyć możliwości krzyżowej reaktywności agonisty i antagonisty MR z GR. Chociaż wiadomo, że fludrokortyzon wywiera pewne działanie glikokortykoidowe, jego powinowactwo do MR jest 15-krotnie wyższe niż do GR (Agarwal i wsp. 1977). Nie było żadnych doniesień, o których wiemy, dotyczących interakcji kwasu kanrenowego z GR w jakiejkolwiek dawce. Po piąte, gdy nie zaobserwowaliśmy wpływu manipulacji na podstawową produkcję steroidów, nie możemy z całą pewnością stwierdzić, że tak nie jest, ponieważ równie prawdopodobną interpretacją byłoby to, że nasze systemy testowe nie są wystarczająco czułe, aby wychwycić niewielkie efekty. Wreszcie, ekstrapolacja tych badań na szczurach do ludzi jest niepewna.

W podsumowaniu, oprócz klasycznych, długich pętli sprzężenia zwrotnego regulujących produkcję steroidów nadnerczowych, obecne badanie wspiera hipotezę, że istnieją ujemne ultrakrótkie pętle regulacyjne mediowane specjalnie przez MR na wydzielanie aldosteronu i GR na produkcję kortykosteronu w izolowanych komórkach ZG i ZF/ZR, odpowiednio. Nieoczekiwanie stwierdzamy, że aktywacja MR również negatywnie reguluje wydzielanie glikokortykoidów w komórkach ZF/ZR. Nie wiadomo, w jaki sposób te krótkie pętle sprzężenia zwrotnego współdziałają z ich długimi pętlami sprzężenia zwrotnego. Jednakże, wyniki te podnoszą intrygujące pytania dotyczące fizjologicznej regulacji i potencjalnej patofizjologicznej dysregulacji produkcji tych steroidów.

.