Abstract
Ta praca bada mechanizm leżący u podstaw poprawiającego wpływu cynku na płodność u otyłych szczurów przy użyciu proteomiki. Badano wpływ trzech różnych dawek ZnSO4 na spermatogenezę i poziom hormonów. Spermatogenezę jąder obserwowano metodą barwienia HE. Poziom estrogenów i testosteronu w surowicy mierzono metodą chemiluminescencyjnych testów immunoenzymatycznych. Analizę proteomiczną plemników przeprowadzono metodą chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas. Baza danych DAVID została wykorzystana do przeprowadzenia analizy wzbogacenia GO i analizy ścieżek KEGG dla różnie wyrażonych genów, a baza danych STRING online została użyta do skonstruowania sieci PPI. Liczba plemników, ruchliwość plemników i hormony testosteronu w grupie szczurów leczonych ZnSO4 były zwiększone. ZnSO4 poprawił strukturę jąder i nieprawidłowości spermatogenezy spowodowane otyłością. Analiza proteomiczna wykazała, że istniało 401 różnie wyrażonych białek w 6 próbkach spermy z grupy leczonej ZnSO4 i z grupy otyłości. Zróżnicowane białka zostały wprowadzone na stronę DAVID. 341 zidentyfikowanych białek zostało następnie sklasyfikowanych zgodnie z ich funkcjami biologicznymi. Analiza KEGG wykazała, że wzbogacone szlaki sygnałowe obejmowały glikolizę/glukoneogenezę, metabolizm węgla, cykl cytrynianowy, metabolizm kwasów tłuszczowych i metabolizm pirogronianu. Wykazano, że niektóre białka są związane ze ścieżkami degradacji waliny, leucyny i izoleucyny. W wyniku analizy STRING uzyskano 36 białek węzłowych. Analiza Cytoscape wykazała, że białka te głównie uczestniczyły w dziewięciu sieciach obejmujących procesy metaboliczne, utlenianie-redukcję, oddychanie tlenowe, splicing RNA i koniugację glutationu. ZnSO4 może poprawić płodność otyłych samców szczurów poprzez regulację ekspresji białek związanych z metabolizmem, stanem zapalnym i dojrzewaniem plemników.
1. Wstęp
Otyłość jest związana z niepłodnością męską. Istnieje pewna zgodność czasowa pomiędzy wzrostem wskaźnika niepłodności męskiej, spadkiem jakości nasienia i wzrostem wskaźnika otyłości. Otyłość prowadzi do patologicznych zmian w ultrastrukturze jąder, a apoptoza komórek spermatogennych jest znacznie nasilona. Zmniejszenie liczby dojrzałych plemników może być jedną z przyczyn prowadzących do niskiej zdolności spermatogenetycznej osób otyłych.
U osób otyłych występują zaburzenia metabolizmu pierwiastków śladowych. Zaburzony poziom metabolizmu pierwiastków śladowych w organizmie będzie wywoływał odpowiednie skutki w metabolizmie lipidów. W męskim układzie rozrodczym jony cynku są rozmieszczone głównie w jądrze, najądrzu, prostacie i nasieniu. Cynk jest markerem funkcji gruczołu krokowego. Ponadto, reguluje funkcje spermy, działa jako kofaktor dla większości reakcji enzymatycznych i pomaga utrzymać ruchliwość plemników. Cynk odgrywa również ważną rolę w rozwoju jąder i tworzeniu plemników. Niedobór cynku znacznie nasila apoptozę komórek zarodkowych w jądrze myszy oraz powoduje zatrzymanie spermatogenezy i uszkodzenie zapłodnienia. Badania wykazały, że otyli mężczyźni są 3,5 razy bardziej narażeni na oligozoospermię niż mężczyźni z prawidłową wagą. Suplementacja cynkiem może zmniejszyć wagę osób otyłych. Stan glukozy we krwi (glukoza na czczo), parametry lipidowe krwi (cholesterol całkowity, poziom triglicerydów, cholesterol lipoprotein o dużej gęstości i cholesterol lipoprotein o małej gęstości) oraz ciśnienie krwi ulegają poprawie po suplementacji cynkiem. Doustny preparat cynku może poprawić zawartość cynku w osoczu nasienia, promować transformację białka jądrowego plemników (tj. z lizyny do argininy) i hamować przedwczesną depolimeryzację jądra plemnika. Może to poprawić ruchliwość plemników i jakość nasienia u niepłodnych pacjentów bez oczywistych skutków ubocznych. Jednak zastosowanie proteomiki w zrozumieniu wpływu leczenia ZnSO4 na białka spermy w otyłości jest nadal ograniczone i wymagane są dalsze badania.
W tym badaniu zbadano wpływ trzech różnych dawek ZnSO4 na spermatogenezę i poziomy hormonalne otyłych szczurów. Mechanizm leżący u podstaw tego efektu był dalej analizowany przez analizę proteomiczną.
2. Materiały i Metody
2.1. Zwierzęta
7-tygodniowe szczury Sprague Dawley (o wadze 180-200 g) zakupiono z Experimental Animal Center of Hebei Medical University. Utrzymywano je w cyklu 12 h ciemność/światło w pomieszczeniu z kontrolowanym powietrzem (temperatura, ; wilgotność, ) ze swobodnym dostępem do wody i karmy dla zwierząt. Wszystkie procedury doświadczalne na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Etyczny Instytutu Planowania Rodziny Hebei Nauki i Technologii.
2.2. Ustanowienie modelu otyłości, grupowanie zwierząt i pobieranie próbek
Szczury zostały losowo podzielone na dwie grupy: grupa normalnej paszy (15 zwierząt w grupie) i grupa modelu otyłości (30 zwierząt w grupie). Każda grupa była karmiona odpowiednimi dietami przez 8 tygodni, tj. normalną dietą chow dla grupy normalnej i dietą wysokotłuszczową dla grupy modelu otyłości. Masy ciała szczurów były ważone co tydzień i rejestrowane przez 8 tygodni. Model otyłości został uznany za udany, gdy średnia masa ciała grupy modelowej była 1,2 razy większa niż grupy kontrolnej. Długość szczurów mierzono (od czubka nosa do odbytu), a wskaźnik Lee obliczano według wzoru .
Po ustanowieniu modelu otyłości, szczury modelowe podzielono losowo na dwie grupy: grupę otyłości i grupę leczoną ZnSO4. Szczury w grupie leczonej ZnSO4 otrzymywały ZnSO4 (Tianjin Yongda Chemical Reagent Company Limited) (3,2 mg/kg/d) przez 4 tygodnie doustnie przez zgłębnik. Pod koniec doświadczenia zmierzono masę ciała, masę jąder, masę najądrzy i tłuszczu okołopęcherzykowego w każdej grupie oraz pobrano krew z aorty brzusznej. Próbki spermy zostały pobrane z najądrza ogonowego. Jądra zostały usunięte.
2.3. Sperm Count and Sperm Motility
Lewe najądrze każdego szczura zostało pobrane natychmiast po uśmierceniu i przeniesione do probówki zawierającej 1 mL ciepłego (37°C) roztworu soli fizjologicznej. Następnie wytrząsano je w temperaturze 37°C przez 5 minut, aby umożliwić rozproszenie plemników. Około 10 μL rozcieńczonej zawiesiny spermy przenoszono do każdej komory zliczeniowej hemocytometru w celu określenia koncentracji i ruchliwości plemników. Ruchliwość mierzono jako odsetek plemników ruchliwych (stopień a+b) wśród wszystkich plemników.
2.4. Oznaczanie stężenia glukozy w surowicy na czczo, lipidów we krwi i insuliny
Poziomy cholesterolu całkowitego, triglicerydów, lipoprotein o małej gęstości i lipoprotein o dużej gęstości w surowicy mierzono w analizatorze Siemens Centaur XP za pomocą zestawu do oznaczania chemiluminescencyjnego z mikrocząsteczkami (Medical System Biotechnology Co., LTD). Glukozę w surowicy na czczo mierzono za pomocą zestawu do wykrywania glukozy (Medical System Biotechnology Co., Ltd., Ningbo, Chiny) na analizatorze ACCUTE TBA-40FR (Toshiba Medical Systems Co., Tokio, Japonia). Poziom insuliny w surowicy oznaczano metodą immunoenzymatyczną w systemie UniCel DxI 800 (Beckman Coulter, CA, USA) z odpowiednimi odczynnikami (Beckman Coulter, CA, USA).
2.5. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Poziom leptyny oznaczono za pomocą zestawów ELISA (Multisciences Biotech Co., Ltd., Hangzhou, Chiny). Po zakończeniu reakcji, absorbancję odczytywano przy 450 nm.
2.6. Barwienie HE
Jądra utrwalano w roztworze Bouina przez noc. Następnie jądra odwodniono przy użyciu alkoholu i osadzono w parafinie. Próbki były wycinane na grubość 5 μm i barwione barwnikiem HE. Spermatogeneza jąder była obserwowana pod mikroskopem świetlnym.
2.7. Pomiar hormonów androgenowych
Poziom estrogenów i testosteronu w surowicy mierzono na analizatorze Siemens Centaur XP metodą chemiluminescencyjnego testu immunoenzymatycznego z mikrocząsteczkami. Zestaw detekcyjny został zakupiony od Siemens Healthcare Diagnostic Inc. i Cayman Chemical, Michigan, USA.
2.8. Chromatografia cieczowa-spektrometria mas
Próbki białka plemników użyte w tym badaniu pochodziły z trzech grup (grupa normalna, grupa modelu otyłości i grupa poddana działaniu ZnSO4). Próbki plemników zostały pobrane z najądrza ogonowego. Białka ekstrahowano za pomocą buforu lizatowego z 8 M mocznikiem, 10 mM DTT i inhibitorem proteazy. Sonikację prowadzono przez 3-5 min. Supernatant zbierano po wirowaniu z prędkością 20000 g przez 10 min w 4°C, a białka oznaczano ilościowo metodą Bradforda. Wyekstrahowane białka inkubowano z 100 mM TEAB do 100 μL, a następnie z 200 mM TCEP w 55°C przez 1 h. Po tym czasie dodawano 5 μL 375 mM jodoacetamidu (IAA). Po inkubacji w ciemności przez 30 min dodawano wstępnie schłodzony aceton i inkubowano przez noc w temperaturze -20°C. Supernatant usuwano ostrożnie po wirowaniu przy 8000 g w 10°C przez 10 min, a lizat pozostawiano w temperaturze pokojowej na 2-3 min do wyschnięcia. Na koniec zmieszano 100 μg białka, 100 μL roztworu 100 mM TEAB i trypsynę w stosunku do białka (1 : 50) i przeprowadzono trawienie enzymatyczne przez noc w temperaturze 37°C.
Chromatografia cieczowa-spekrometria masowa: pobrano częściowo strawione próbki i rozpuszczono w roztworze A (2% ACN/98% H2O/0,1% FA). Po wirowaniu przy 20000 g przez 30 minut, pobierano supernatant, a sekwencję białek wykrywano za pomocą spektrometru mas EASY-nLC liquid phase-Q Exactive (American Thermo Fisher).
Warunki spektrometrii mas to 90 min dla czasu akwizycji danych, 2 kV dla napięcia rozpylania, 320°C dla temperatury kapilary, 27% dla znormalizowanej energii kolizji i 300-1400 Da dla zakresu mas kolekcji. Podstawowymi parametrami były: 70000 dla rozdzielczości, 36 dla celu AGC, 60 ms dla maksymalnego IT i profil dla typu danych widma. Parametry wtórne wynosiły 17500 dla rozdzielczości, 54 dla celu AGC, 80 ms dla maksymalnego IT i 3.0 m/z dla okna izolacyjnego.
2.9. Data Retrieval
W wyszukiwarce MaxQuant 1.5.2.8 błąd pierwszy wynosi 20 ppm, błąd drugi 0,02 Da. Ustalona modyfikacja jest następująca. Cysteina jest zmodyfikowana do Carbamidomethyl-Cys, a zmienna modyfikacja jest następująca: Oksydacja-M, LizaC lub Trypsyna, lub trawienie Glu-C. Trawienie enzymatyczne dopuszcza do 2 brakujących miejsc. Wypełnianie luk w danych, normalizacja i screening różnic () zostały wykonane przy użyciu standardowych ustawień oprogramowania Perseus. W sumie zidentyfikowano i oznaczono ilościowo 1344 białka w 6 próbkach z obu grup. Uzyskano jakościowe i ilościowe informacje o zróżnicowaniu białek Zn i grupy G. Oprogramowanie Perseus wykonało test i analizę istotności wyników ilościowych i proporcji białek. Uzyskana lista białek różnicowych jest następująca: łącznie 401 znaczących białek różnicowych uzyskano na podstawie wyników -testu i wyników analizy rozkładu różnicowego.
2.10. Analiza GO (Gene Ontology) i KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)
Białka różnicowe zostały zaimportowane do strony internetowej DAVID (Functional Annotation Bioinformatics Microarray Analysis) (https://david.ncifcrf.gov/) w celu podstawowej ekstrakcji bioinformatycznej. Narzędzia internetowe dostarczone przez DAVID zostały wykorzystane do wyszukiwania funkcjonalnych terminów anotacji i ścieżek, które były wzbogacone w wyżej zidentyfikowane białka, w tym składnik komórkowy, funkcję molekularną i proces biologiczny.
2.11. Protein Interaction Network Analysis
Różnicowe białka poddane screeningowi zostały zaimportowane do internetowej bazy danych STRING (https://string-db.org/) w celu analizy. Wykreślono mapę sieci interakcji genów różnicowych. Interaktywne dane sieciowe zostały wyeksportowane do oprogramowania Cytoscape 3.2 w celu określenia białka węzła centralnego sieci.
2.12. Analiza statystyczna
Dane były wyświetlane jako . Analizę statystyczną przeprowadzono w programie SPSS22.0 z wykorzystaniem jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA), przy czym wartość < 0,05 uznano za istotną statystycznie.
3. Wyniki
3.1. Semen Parameters and Testosterone Hormone Level Changes in Sperm after ZnSO4 Treatment
W porównaniu z grupą kontrolną, masa ciała, tłuszcz okołopęcherzowy, indeks Lee, cholesterole całkowite, trójglicerydy, lipoproteiny o wysokiej gęstości i leptyna szczurów z grupy otyłości oraz leptyna szczurów z grupy leczonej ZnSO4 wzrosły istotnie. W porównaniu z grupą kontrolną, lipoproteina o niskiej gęstości szczurów z grupy otyłości zmniejszyła się znacząco. W porównaniu z grupą z otyłością, masa ciała, tłuszcz okołonerkowy i wskaźnik Lee zmniejszyły się w grupie leczonej ZnSO4, a różnica była statystycznie istotna (Tabela 1). W celu wykrycia wpływu ZnSO4 na płodność szczurów, każda grupa parametrów nasienia została najpierw oceniona zgodnie z kryteriami WHO 2010 . Liczba plemników i ruchliwość plemników były zahamowane w grupie z otyłością, jak pokazano w tabeli 2. W porównaniu z grupą z otyłością, liczba plemników i ruchliwość plemników szczurów leczonych ZnSO4 wzrosła, co sugeruje, że ZnSO4 poprawia parametry nasienia u otyłych szczurów. Otyłość sama w sobie może powodować wzrost lipidów we krwi, ale nasze wyniki wykazały, że poziom glukozy we krwi, lipidów i insuliny nie osiągnął poziomu cukrzycy. Można więc uznać, że czynniki zakłócające powikłania cukrzycowe zostały wykluczone. Ponadto oznaczono poziom testosteronu w surowicy. Wyniki wykazały, że hormony testosteronu wzrosły w grupie leczonej ZnSO4 w porównaniu z grupą otyłości (Tabela 2). Tak więc, leczenie ZnSO4 może poprawić jakość nasienia otyłych szczurów.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
Uwaga: # w porównaniu z normalną kontrolą; w porównaniu z otyłością.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||||||||||||
|
Uwaga: w porównaniu z normalną kontrolą; w porównaniu z otyłością.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||
3.2. ZnSO4 Treatment Improves the Recovery of Testicular Impairment Induced by Obesity
Następnie przeprowadziliśmy analizę histologiczną tkanki jąder, a wyniki przedstawiono na rycinie 1. Według histologii jąder, normalna grupa wykazała normalną spermatogenezę (ryc. 1(a) i 1(d)), podczas gdy grupa otyłości wykazała zaburzoną spermatogenezę, ponieważ światło kanalików nasiennych było prawie puste (ryc. 1(b) i 1(e)). Zgodnie z naszymi oczekiwaniami, grupa leczona ZnSO4 wykazała znaczącą poprawę w porównaniu z grupą z otyłością w histologii jądra, z pojawieniem się normalnych komórek Sertoliego i Leydiga oraz niezaburzoną spermatogenezą (ryc. 1(c) i 1(f)). Tak więc, ZnSO4 może poprawić strukturę jąder i nieprawidłowości spermatogenezy spowodowane otyłością.
3.3. Classification of 341 Sperm Proteins by Bioinformatics: Cellular Component, Molecular Function, and Biological Process
Aby określić różnie wyrażone białka, przeprowadzono analizę proteomiczną. W sumie 1344 białka zostały zidentyfikowane i określone ilościowo w 6 próbkach nasienia z grupy leczonej ZnSO4 i z grupy otyłości. Oprogramowanie Perseus przeprowadziło analizę -testów i analizę istotności różnicowej wyników ilościowych i proporcji białek. W sumie uzyskano 401 białek znaczących. Białka różnicowe zostały wprowadzone na stronę DAVID dla różnic w funkcji białek w grupie leczonej ZnSO4 i grupie z otyłością. W klasyfikacji GO przeanalizowano 371 białek, a 30 białek nie odpowiadało. 341 zidentyfikowanych białek zostało następnie sklasyfikowanych zgodnie z ich funkcjami biologicznymi. Użyliśmy narzędzi internetowych dostarczonych przez DAVID do wyszukiwania funkcjonalnych terminów anotacji i ścieżek, które były wzbogacone w wyżej zidentyfikowane białka. Wyniki tych analiz zostały przedstawione na Rysunku 2. Skupiliśmy się na ontologii składnika komórkowego, funkcji molekularnej i procesu biologicznego dla analizy wzbogacenia terminów funkcjonalnych z i .
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
W grupie „składnik komórkowy” (Rysunek 2(a)), analiza kategorii wykazała, że 59% białek o znaczących różnicach było składnikami organelli, a 60,7% z nich było składnikami organelli. Ponadto, 29,6% białek należało do kompleksu wielkocząsteczkowego. Analiza terminów GO „funkcja molekularna” wykazała, że 22% białek zostało sklasyfikowanych jako białka o aktywności katalitycznej (Rysunek 2(b)). Pozostałe białka mogły być sklasyfikowane jako białka wiążące białka, wiążące rRNA i wiążące enzymy. Jeśli chodzi o bazę danych „proces biologiczny” (Rysunek 2(c)), większość z 24% białek była związana z procesem metabolicznym. Ponadto, białka były związane z transportem, transdukcją sygnału, śmiercią komórek, adhezją komórek, procesami układu odpornościowego i reprodukcją. Wyniki analizy ścieżek sygnałowych (Rysunek 2(d)) z koncentracją białek i wzbogaceniem są następujące. Wiele szlaków metabolicznych, takich jak glikoliza/glukoneogeneza, metabolizm węgla, cykl cytrynianowy (cykl TCA), metabolizm kwasów tłuszczowych i metabolizm pirogronianu zostały zakłócone i dotknięte, a niektóre białka okazały się być związane z waliną, leucyną i szlakami degradacji izoleucyny.
3.4. Zinc Effects Are Further Identified by Differentially Expressed Sperm Proteins
Analiza kwantyfikacyjna została przeprowadzona w celu porównania poziomów białek pomiędzy trzema grupami. Wśród białek różnicujących wybrano białka metaboliczne, białka związane z transportem cynku oraz białka węzłowe w sieci (Tabela 3). Białka z istotnymi statystycznie zmianami zostały przedstawione na Rycinie 3. Do białek tych należały ARG2, COX5B, ZNT1, LYAR i TM165. W porównaniu z grupą z otyłością, ekspresja ARG2, COX5B i ZNT1 w grupie leczonej ZnSO4 była istotnie zmniejszona, natomiast ekspresja LYAR i TM165 była istotnie zwiększona.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3.5. The Differential Protein Interaction Network Is Established Using the STRING Network Database
STRING jest oprogramowaniem do analizy online, które analizuje i przewiduje interakcje pomiędzy znanymi białkami. Oprogramowanie STRING ustanawia mechanizm punktacji, aby nadać odpowiednie wagi różnym źródłom danych i w końcu daje kompleksowy wynik, a następnie konstruuje mapę sieci interakcji białko-białko. 341 różnicowych białek zostało zaimportowanych do internetowej bazy danych STRING (http://string-db.org/) w celu analizy i 341 białek zostało zidentyfikowanych, a różnicowa mapa sieci interakcji genów została wygenerowana. Po tym, interaktywne dane sieciowe zostały wyeksportowane do oprogramowania Cytoscape 3.2 w celu określenia białek węzła centralnego sieci. Można zauważyć, że sieć różnicowego składu białek jest złożona (Rysunek 4). Następnie wykorzystaliśmy plugin Cytoscape do analizy białek węzłowych w sieci, a w wyniku analizy otrzymaliśmy łącznie 36 białek węzłowych (Tabela 3). Z listy najlepszych sieci wygenerowanych za pomocą STRING wybraliśmy podsieci. Analiza Cytoscape wykazała, że białka te uczestniczyły głównie w dziewięciu sieciach obejmujących proces metaboliczny, utlenianie-redukcję, oddychanie tlenowe, splicing RNA i koniugację glutationu.
4. Dyskusja
WHO definiuje osobę z nieprawidłową lub nadmierną akumulacją tłuszczu jako nadwagę lub otyłość, a stan ten stanowi rosnące zagrożenie dla zdrowia ludzi na całym świecie . Niektóre doniesienia wskazują, że częstość występowania otyłości gwałtownie wzrasta, co nie tylko zwiększa ryzyko chorób, ale także równolegle zwiększa ryzyko rozwoju zaburzeń układu rozrodczego u pacjentów. Ponieważ funkcja reprodukcyjna mężczyzn pogarsza się globalnie, coraz więcej osób zdaje sobie sprawę, że otyłość obniża jakość nasienia. Wraz ze wzrostem BMI dochodzi do zmiany parametrów nasienia, a tym samym do zmiany struktury fizycznej i molekularnej plemników. Wcześniejsze badania wykazały, że wysokie BMI miało negatywny wpływ na koncentrację plemników i całkowitą liczbę ruchliwych plemników. W obecnym badaniu, szczury w grupach z otyłością wykazały znaczący spadek koncentracji plemników i ruchliwości plemników w porównaniu z tymi w grupie o normalnej wadze, podczas gdy ZnSO4 poprawił parametry nasienia w porównaniu z grupą z otyłością.
Nierównowaga hormonów płciowych może wpływać na męską reprodukcję, a status nadwagi może wpływać na poziom hormonów u mężczyzn. Jednocześnie badania wykazały, że otyłość jest ściśle związana z zaburzeniami endokrynologicznymi, takimi jak nieprawidłowości hormonów płciowych. Otyłość u mężczyzn ma negatywny wpływ na męski potencjał reprodukcyjny z powodu zmian w poziomie hormonów. Dlatego też zbadaliśmy poziom hormonów w surowicy krwi w każdej z grup. Poziom hormonów testosteronu wzrósł w grupie leczonej ZnSO4 w porównaniu z grupą normalną i grupą otyłości. Wydaje się, że leczenie ZnSO4 znacznie zwiększyło poziom hormonów androgenowych, aby dopasować się do poziomu normalnej grupy kontrolnej. Zmniejszona masa ciała i poziom lipidów we krwi u szczurów leczonych ZnSO4 może naprawić komórki Leydiga, zwiększając w ten sposób poziom testosteronu. W konsekwencji, funkcjonalny męski układ rozrodczy może zostać zregenerowany, wspomagając spermatogenezę i regenerację struktury jądra. Najwyraźniej histologia jądra w grupie leczonej ZnSO4 uległa poprawie z regeneracją komórek Sertoliego i Leydiga oraz przywróceniem plemników w świetle jądra. Dlatego też proteomika porównawcza na dużą skalę zapewnia skuteczne podejście do identyfikacji wszelkich różnic w ekspresji białek między grupami otyłymi i leczonymi ZnSO4. Nasze badanie zidentyfikowało różnice w profilach ekspresji białek między normalnymi płodnymi plemnikami a plemnikami z grup leczonych ZnSO4.
Analiza adnotacjiGO wykazała, że 24% białek było związanych z procesem metabolicznym, a 22% białek zostało sklasyfikowanych jako białka o aktywności katalitycznej. Pozostałe białka zostały sklasyfikowane jako wiążące białka, wiążące rRNA i wiążące enzymy, w tym wiążące ATP. Wiadomo, że białka wiążące ATP odgrywają fundamentalną rolę w procesach biologicznych, co wskazuje na zmiany w procesach syntetycznych i metabolicznych. Mitochondria są organellami, które dostarczają energii (ATP) do komórek. Mitochondria są również głównym celem stresu oksydacyjnego. W organizmie mężczyzny mitochondria są główną elektrownią w procesie dojrzewania komórek spermatogennych, a także dostarczają energii plemnikom po ejakulacji. Dlatego też, gdy stres oksydacyjny występuje u otyłych mężczyzn, mitochondria w plemnikach mogą ulec znacznemu uszkodzeniu. Plemniki są podatne na stres oksydacyjny i nie mają zdolności do naprawy uszkodzeń. Dieta wysokotłuszczowa wywołuje stres oksydacyjny u otyłych szczurów, który indukuje uszkodzenia błony mitochondrialnej plemników i wpływa na funkcje mitochondriów. Egwurugwu i wsp. stwierdzili, że siarczan cynku miał pewne znaczące pozytywne efekty na androgen i jakość spermy w dawkach fizjologicznych. Jednak było to szkodliwe w wyższych dawkach.
ARG2 jest znany do lokalizacji w mitochondriach . Odgrywa również kluczową rolę w produkcji ornityny, która jest prekursorem proliny, hydroksyproliny i poliaminy, i jest niezbędna do proliferacji komórek. Otyłość i związane z nią choroby charakteryzują się niskim poziomem przewlekłego stanu zapalnego. ARG2 promuje prozapalne odpowiedzi w makrofagach i przyczynia się do dowodów miażdżycy i insulinooporności związanej z otyłością. Uważamy, że wczesna otyłość może prowadzić do upregulacji arginazy, co skutkuje ogólnoustrojowymi zmianami w arginazie i metabolitach argininy. Upregulation ARG2 w grupie otyłych może być związane z proliferacją komórek i przewlekłym stanem zapalnym spowodowanym otyłością. Arginaza poprawia wywołane otyłością zaburzenia lipidowe wątroby i systemowe nieprawidłowości tłuszczowe poprzez hamowanie aktywacji szlaków zaangażowanych w metabolizm triglicerydów wątrobowych i funkcję mitochondriów .
Of these proteins, COX5B particularly is of high interest and linked to mitochondrial function and cellular energy production . Oksydaza cytochromowa (COX, Kompleks IV) jest mitochondrialnym enzymem łańcucha transportu elektronów, który znajduje się w wewnętrznej błonie mitochondrialnej, a jego aktywność jest wymagana do generowania siły napędowej protonów, która napędza syntezę ATP. Jest to jedna z trzech mitochondrialnych izoform oksydazy cytochromowej, czyli kompleksu IV mitochondrialnego łańcucha oddechowego. COX5B jest zaangażowany w końcowy etap fosforylacji oksydacyjnej, z produkcją H2O i utrzymaniem gradientu elektrochemicznego potrzebnego do produkcji ATP. Tak więc obniżone poziomy ARG2 i COX5B u szczurów leczonych siarczanem cynku mogą sugerować indukowany cynkiem wpływ na płodność u otyłych szczurów, zwłaszcza w regeneracji jąder, spermatogenezie i ruchliwości plemników.
Niektóre różnie wyrażone białka zidentyfikowane w tym badaniu są zaangażowane w proces transportu cynku. Na przykład, Elgazar i wsp. stwierdzili, że ZnT1 jest obecny w błonie plazmatycznej i cytoplazmie komórek podporowych. Badania wykazały, że Znt1 odgrywa ważną rolę w homeostazie cynku u dorosłych myszy . Metal-responsive transcription factor-1 (MTF-1) odgrywa rolę w koordynowaniu odpowiedzi komórkowych na homeostazę metali i stres oksydacyjny. MTF-1 jest zależnym od cynku czynnikiem transkrypcyjnym, który stymuluje geny metalotioneiny i transportera cynku-1 (ZNT-1) wraz ze wzrostem stężenia cynku. Foster i wsp. wykazali, że względna ekspresja mRNA transporterów cynku jest bardzo zróżnicowana. ZnT1 jest najliczniej występującym transporterem w jądrze i bierze udział w transporcie cynku przez błonę plazmatyczną. Noh i wsp. donoszą, że poziom ZnT1 mRNA był nieznacznie podwyższony u otyłych kobiet, a zmiany w transporterze cynku mogą być również związane ze stanami zapalnymi związanymi z otyłością.
Ly1 antibody reactive homolog (LYAR) został po raz pierwszy opisany przez Su i wsp. jako cDNA kodujący białko palca cynkowego wyizolowane z linii mysiej białaczki T-komórkowej. Gen Lyar, o którym wiadomo, że ulega obfitej ekspresji w jądrze, koduje białko jąderkowe, które zawiera motyw palca cynkowego C2HC typu LYAR i trzy sygnały lokalizacji jądrowej. Lee i wsp. stwierdzili, że białko LYAR było obecne w spermatocytach i spermatydach, ale nie w plemnikach. Natomiast my wykryliśmy ekspresję LYAR w plemnikach, a jego ekspresja zmniejszyła się w plemnikach szczurów otyłych i zwiększyła w grupie poddanej działaniu ZnSO4. LYAR jest identyfikowany jako związany z cytoplazmatycznymi rybosomami w męskich komórkach zarodkowych i nowotworowych i jest zaangażowany w przetwarzanie prerybosomalnego RNA w jądrze. LYAR jest modulatorem jednego z dwóch podstawowych etapów inicjacji translacji w męskich komórkach zarodkowych ssaków i niektórych typach nowotworów. LYAR znacząco hamuje transkrypcję genów stresu oksydacyjnego, w tym SLC7A11, HMOX1 i CHAC1. Onkoproteina Myc zwiększa ekspresję LYAR poprzez aktywację transkrypcji jego genu, a wzrost LYAR z kolei chroni komórki nowotworowe przed apoptozą wywołaną stresem oksydacyjnym poprzez zmniejszenie ekspresji genu CHAC1.
Białko transbłonowe 165 (TM165) jest białkiem transmembranowym Golgiego, a jego niedobór powoduje wrodzone zaburzenie glikozylacji. TM165 jest zarówno transkrypcyjnie jak i translacyjnie nadekspresyjne w raku wątrobowokomórkowym i związane ze zdolnością inwazyjną raka wątrobowokomórkowego. Jednak dane uzyskane w ostatnich badaniach dają kilka wskazówek na ich implikację w homeostazie wapnia i manganu. TM165 dostarcza Ca2+ i Mn2+ do kompleksu Golgiego w zamian za H+ w celu podtrzymania funkcji syntazy laktozy i potencjalnie innych glikozylotransferaz. Ludzkie białko Golgiego TM165 może transportować wapń i mangan w komórkach drożdży i bakterii. Nasze badanie wykazało, że ekspresja TM165 u otyłych szczurów zmniejszyła się i wzrosła po suplementacji cynkiem, co sugeruje, że TM165 wzrosła po suplementacji cynkiem.
5. Wnioski
W podsumowaniu, wyniki tego badania dostarczają dowodów na to, że ZnSO4 może poprawić poziom hormonów, regenerację jąder i płodność. Analiza proteomiczna pokazuje ponadto, że ZnSO4 może poprawić płodność otyłych samców szczurów poprzez regulację ekspresji białek związanych z metabolizmem, stanem zapalnym, dojrzewaniem plemników i innymi interakcjami.
Dostępność danych
Dane użyte do poparcia wyników tego badania są dostępne na żądanie.
Ujawnienie
Agencja finansująca nie miała wpływu na projekt badania, zbieranie i analizę danych, decyzję o publikacji lub przygotowanie manuskryptu.
Konflikt interesów
Autorzy oświadczają, że nie ma konfliktu interesów dotyczącego publikacji tej pracy.
Podziękowania
Badanie to było wspierane przez Hebei Provincial Government Funded Clinical Medicine Excellent Talents Training and Basic Research Project (Grant No. 20170183).
Przedmiotowe badanie zostało wsparte przez Hebei Provincial Government Funded Clinical Medicine Excellent Talents Training and Basic Research Project (Grant No. 20170183).