Układ płciowy samicy krowy. A) Przedstawiono macicę (UT), jajnik (OV) i jajowód (OD). B) Powiększenie otoczonego regionu na rycinie 1A przedstawiające szczegółowo drogi rodne, gdzie można zidentyfikować ampułkę i połączenie cewkowo-maciczne.

Ochrona i przeżywalność gamet

Doniesiono, że obecność płynu jajowodowego ma pozytywny wpływ na żywotność plemników (Killian, 2011) oraz że jajowód dostarcza składników odżywczych niezbędnych do przeżycia oocytów i enzymów o działaniu antyoksydacyjnym w płynie jajowodowym (Leese i in., 2008; Avilés et al., 2010). Enzymy te są szczególnie istotne dla plemników, ponieważ łatwo ulegają one uszkodzeniu pod wpływem reaktywnych form tlenu (ROS), które modyfikują błonę plazmatyczną (peroksydacja białek i lipidów), co może prowadzić do uszkodzeń DNA (Aitken i Luliis, 2010). Ponadto, plemniki w drogach rodnych kobiety są traktowane jako komórki obce, co wpływa na przeżywalność plemników ze względu na nadzór immunologiczny (Kawano i in., 2014). W jaki sposób proces ten jest regulowany pozostaje do wyjaśnienia, ale to, co nie ulega wątpliwości, to fakt, że środowisko jajowodu chroni plemniki. Dowodem potwierdzającym tę tezę może być fakt, że plemniki mogą przetrwać w jajowodzie od jednego lub dwóch dni w przypadku krów lub loch do 6 mo w przypadku nietoperza (Holt, 2011).

Dojrzewanie komórki jajowej w jajowodzie

Donoszono, że czas życia komórki jajowej w jajowodzie wynosi u człowieka około 24 godzin, co jest podobne u większości analizowanych dotychczas gatunków. Pies jest jednak wyjątkowy, ponieważ oocyt uwalniany przez jajnik w czasie owulacji jest niedojrzały i musi przebywać w jajowodzie od 2 do 3 dni, by dojrzeć przed zapłodnieniem (Tsutsui i in., 2009). U niektórych gatunków skuteczność zapłodnienia in vitro (IVF) jest wciąż niska, głównie z powodu niedostatecznej standaryzacji technik ART (Mondéjar i in., 2012). Jednakże, aby wyjaśnić różnice pomiędzy efektywnością zapłodnienia in vivo i in vitro, można rozważyć dwie hipotezy związane z dojrzewaniem oocytów w jajowodzie: (i) Wydarzenia zachodzące w jajowodzie nie mają fundamentalnego znaczenia, ale ponieważ nie zachodzą podczas procedur in vitro, przeżywają tylko oocyty najwyższej jakości. Byłoby to powodem mniejszego odsetka sukcesów w ART w porównaniu z in vivo. (ii) Oocyty wykorzystywane w procedurach in vitro są gorszej jakości niż te fizjologicznie owulowane i zapładniane w jajowodzie, w wyniku czego powstają zarodki ze zmianami w nieżywotnych, ale ważnych dla ich zdrowia w okresie dorosłości cechach, takich jak np. ślady epigenetyczne (El Hajj i Haaf, 2013). Kilka białek w płynie jajowodowym może wiązać się z pozakomórkowym płaszczem oocytu zwanym zona pellucida (ZP), modyfikując zarówno jego skład białkowy, jak i węglowodanowy. I tak, wykazano, że glikoproteina specyficzna dla jajowodu (OVGP1), osteopontyna, syntaza prostaglandyny D typu lipokalinowego oraz laktoferyna wiążą się z ZP różnych gatunków (Goncalves i in., 2008). OVGP1 jest najczęściej badanym białkiem związanym z ZP, a jego rola w przedpłodowym utwardzaniu ZP, które zmniejsza polispermię u świni została wykazana (Coy i in., 2008).

Wiele mechanizmów uczestniczących w wiązaniu plemnik-ZP oraz w ogólnym procesie zapłodnienia (regulującym możliwość polispermii) jest modulowanych przez jajowód. W przypadku przedpłodowego utwardzania ZP, seria eksperymentów z oocytami dziewięciu gatunków i płynami jajowodowymi pięciu gatunków wskazała, że krótka inkubacja oocytu jajnikowego z płynem jajowodowym powoduje wyraźną zmianę odporności ZP na trawienie enzymatyczne (Mondéjar i in., 2013). Uzyskane wyniki nie były jednak identyczne, co wskazuje na pewien stopień specyficzności, który może wynikać z (i) różnego składu białkowego płynu jajowodowego lub nawet innej sekwencji białkowej kodowanej przez ortologiczny gen, jak wykazano w przypadku OVGP1 (Avilés i in., 2010) lub (ii) innego składu ZP (białkowego i węglowodanowego; Stetson i in., 2012). Niektóre z różnic między gatunkami mogą wynikać nawet z braku białka, jak to ma miejsce w przypadku OVGP1 u konia i szczura. Co więcej, u konia plemnik nie jest w stanie zapłodnić oocytu in vitro, jednak gdy oocyt jest inkubowany z płynem z jajowodu świni lub białkiem jajowodowym DMBT1, wskaźnik zapłodnienia znacznie wzrasta (Ambruosi i in., 2013), wykazując znaczenie jajowodu u tego gatunku.

Plemniki w jajowodzie

Plemniki przylegają do nabłonka jajowodu w rejonie cieśni. Wiązanie to jest odpowiedzialne za utworzenie rezerwuaru plemników oczekujących na moment owulacji. Takie wi±zanie jest ważne nie tylko dla zachowania żywotno¶ci plemników, ale także dla zablokowania przedwczesnej kapacytacji, która mogłaby zagrozić lub nawet uniemożliwić zapłodnienie. W uwolnieniu plemników z tego rezerwuaru wydają się pośredniczyć różne czynniki, w tym sygnały przekazywane przez kompleks cumulus-oocyt (COC), składniki jajowodu modyfikujące wiązanie plemników, a także zmiany w poziomie progesteronu i estradiolu oraz hiperaktywacja ruchliwości plemników (Suarez, 2006, 2008; Kölle i in…, 2009; Talevi i Gualtieri, 2010; Coy et al., 2012).

Plemniki uwolnione w czasie ejakulacji nie są zdolne do zapłodnienia komórki jajowej i muszą przebywać w drogach rodnych kobiety, zanim nabędą zdolność do zakończenia procesu zapłodnienia. Różne zmiany biologiczne, którym ulegają plemniki w żeńskich drogach rodnych znane są jako kapacytacja, proces odkryty niezależnie przez Austina (1951) i Changa (1951) z wykorzystaniem królika jako modelu zwierzęcego. Szczegółowy mechanizm molekularny zaangażowany w ten proces nie jest jeszcze znany, głównie z powodu trudności w ustaleniu, co tak naprawdę dzieje się wewnątrz jajowodu. Zmiany obserwowane w plemnikach mogą być wywołane redystrybucją lub uwalnianiem białek, choć w grę mogą wchodzić również inne czynniki (Yanagimachi, 1994; Florman i Ducibella, 2006). Stwierdzono, że plemniki są modyfikowane przez wiązanie różnych białek jajowodowych (osteopontyna i OVGP1), które generalnie zwiększają żywotność, ruchliwość i kapacytację plemników u kilku gatunków (Kan i in., 2006; Killian, 2011). Tak więc OVGP1 jest w stanie nie tylko wiązać ZP i plemniki, ale również zwiększać fosforylację białek w plemnikach, co jest związane z kapacytacją plemników (Kan i in., 2006). Inne mechanizmy zaangażowane w kapacytację plemników bydlęcych i świńskich związane są z obecnością różnych glikozydaz w płynie jajowodowym (Carrasco i in., 2008) oraz w nabłonku jajowodu (Ma i in., 2012). Ponadto, niedawno opisano uwalnianie sialidazy z błony plazmatycznej plemników podczas kapacytacji (Ma i in., 2012). Glikozydazy te mogą modulować wiązanie plemników do nabłonka jajowodu i w konsekwencji ich uwalnianie z rezerwuaru nasienia. Bardzo niedawno po raz pierwszy opisano istnienie nowego mechanizmu odpowiedzialnego za specyficzne zmiany mediowane przez małe pęcherzyki (egzosomy) podczas tranzytu plemników przez jajowód (Al-Dossary i in., 2013). Ostatnie badania z wykorzystaniem genetycznie zmodyfikowanych myszy dostarczyły mocnych dowodów na znaczenie żeńskiego układu płciowego w płodności plemników (Kawano i in., 2010; Turunen i in., 2012). Takie zmodyfikowane myszy są subpłodne lub nie są w stanie zapłodnić komórki jajowej przy użyciu technik IVF. Jednak te genetycznie zmodyfikowane samce myszy są płodne in vivo. Stwierdzono, że ich plemniki są zdolne do zapłodnienia komórki jajowej za pomocą technik IVF, gdy są inkubowane z wydzielinami macicy, w czym mogą pośredniczyć egzosomy, jak opisano powyżej (Kawano i in., 2010). Wydzieliny żeńskich narządów płciowych mogą być wykorzystane do poprawy zdolności zapłodnienia in vitro w przypadku mężczyzn o istotnej wartości genetycznej, ale o słabej płodności.

Transport gamet i zarodków w jajowodzie

Gamety i zarodki muszą znaleźć się we właściwym miejscu we właściwym czasie; w związku z tym jajowód w znacznym stopniu przyczynia się do tego procesu. Plemniki muszą dotrzeć do ampułki jajowodu, aby zapłodnić komórkę jajową. Po zapłodnieniu, zygota i wczesne zarodki powinny zostać przetransportowane do macicy, aby umożliwić implantację blastocysty w endometrium (błonie śluzowej macicy). Jednak mechanizm ten nie jest tak prosty, jak się spodziewano.

Transport oocytów i zarodków

Oocyty i zarodki są niemotylne. Oocyty są otoczone przez dużą liczbę komórek (komórki cumulus) w czasie owulacji, gdy tworzą strukturę zwaną cumulus oophorus, która jest wychwytywana przez infundibulum (Ryc. 2). Nie mają one zdolności poruszania się tak, jak plemniki i muszą być transportowane w sposób bierny. Stwierdzono, że niewielkie zmiany w poziomie ekspansji cumulusów wpływają na początkową adhezję kompleksów cumulus-oocyt do nabłonka infundibulum, utrudniając ich dalszy transport (Suarez, 2006). W transporcie oocytu do miejsca zapłodnienia biorą udział dwa istotne komponenty: skoordynowane skurcze komórek mięśni gładkich (myosalpinx lub warstwa mięśniowa) na całej długości jajowodu oraz rzęskowy rytm komórek nabłonka (Ryc. 4). Jeśli skurcze jajowodu ulegną zmianie, oocyt nie dotrze do miejsca zapłodnienia u myszy (Dixon i in., 2009). Zarodki i oocyty są transportowane z różną prędkością w jajowodzie klaczy i szczura (Suarez, 2006). Dlatego też prostaglandyna E2 produkowana przez zarodki jest zaangażowana w ten proces. Ostatnio doniesiono, że zarodki indukują zmiany w ekspresji genów w jajowodzie i w konsekwencji mogą modulować własne środowisko (Almiñana i in., 2012).

Transport plemników

Pomimo dużej liczby plemników uwalnianych podczas ejakulacji (ponad 40 mln i 37.5 miliardów odpowiednio dla człowieka i dzika), tylko nieliczne plemniki są w stanie dotrzeć do ampułki (100-1000 i 5000 odpowiednio dla człowieka i dzika), a duża ich liczba jest odrzucana (Harper, 1994; Hunter, 2012a; Suarez, 2006). Obecność zredukowanej liczby plemników w miejscu zapłodnienia oznacza, że stosunek oocyt:plemnik jest zbliżony do 1:1. Jest to ważne, ponieważ duża liczba plemników zwiększyłaby polispermię, która jest śmiertelna dla zarodków ssaków (Hunter, 2012a). Mechanizm, za pomocą którego plemniki odnajdują oocyty jest wciąż nieznany. Ostatnie badania sugerują, że plemniki docierają do miejsca zapłodnienia w wyniku mechanizmu chemotaksji i/lub termotaksji (Eisenbach i Giojalas, 2006; Hunter, 2012b), procesów, które byłyby odpowiedzialne za kierowanie plemników do górnej części jajowodu. Sugeruje się, że w proces ten zaangażowany jest gradient chemiczny, w którym pośredniczy progesteron produkowany przez komórki cumulus (Eisenbach i Giojalas, 2006; Coy i in., 2012; Guidobaldi i in., 2012). U myszy, u których komórki jajowe uległy denudacji, nie dochodzi do zapłodnienia in vivo, jednak oocyty te mogą zostać zapłodnione in vitro, co sugeruje związek tej struktury z sytuacją in vivo (Zhuo i in., 2001). Badania te wskazuj± na znaczenie cumulus oophorus i przypominaj±, że dane uzyskane przy użyciu modeli in vitro wymagaj± ostrożnej interpretacji; ponadto podkre¶laj± one potrzebę stworzenia dokładniejszych modeli in vitro, które w większym stopniu na¶ladowałyby ¶rodowisko in vivo. Do tej pory postęp w tym zakresie jest powolny. Można by się spodziewać, że wejście plemników do jajowodu jest stosunkowo prostym procesem, zależnym od skurczu mięśni macicy i ruchliwości plemników ukierunkowanej chemo- lub termotaksją. Wykazano jednak, że plemniki nie są w stanie przekroczyć połączenia cewkowo-macicznego, gdy jedno z białek plemnikowych (np. ADAM3) jest zmodyfikowane (Okabe, 2013). Pozostaje do odkrycia, jakie specyficzne interakcje molekularne istnieją między plemnikiem a jajowodem, które umożliwiają wejście plemnika do jajowodu.

Effect of the Oviductal Environment on Embryo Development

Fakt, że zarodki można uzyskać in vitro i że dawczynie nieposiadające własnych zarodków w macicy mogą założyć ciążę po transferze zarodka, podważa rolę jajowodu. Wykazano jednak u różnych gatunków, że jakość blastocysty uzyskanej po hodowli zarodków w jajowodzie jest lepsza w porównaniu z zarodkami wytworzonymi in vitro, przynajmniej pod względem morfologii, ekspresji genów, kriotolerancji i wskaźnika ciąż po transferze (Rizos i in., 2007; 2010a; Mondéjar i in., 2012; Van Soom i in., 2014). Dowodzi to, że jajowód nie jest narządem służącym jedynie do transportu zygoty/wczesnego zarodka przez macicę, ale że istnieje między nimi komunikacja. Pierwsze etapy rozwoju zarodka zachodzą w jajowodzie, gdzie spędza on około 4 do 5 dni, niezależnie od dużych różnic w długości jajowodów obserwowanych u kilku gatunków (porównaj Ryc. 1 i 2b; Suarez, 2006; Wang i Dey, 2006). W tym okresie ma miejsce kilka ważnych wydarzeń, z których pierwszym jest proces rozszczepienia i przejście od genomu matczynego do genomu embrionalnego. Każda modyfikacja środowiska hodowlanego, która wpływa na którykolwiek z tych procesów, może mieć głęboki wpływ na jakość blastocysty (Lonergan i in., 2003a). Ostatnio stwierdzono, że zmiana warunków hodowli z in vivo na in vitro, lub odwrotnie, w określonym punkcie wczesnego rozwoju zarodka, przed lub po aktywacji genomu zarodkowego, krytycznie wpływa na wzorce ekspresji genów w powstałych blastocystach (Gad i in., 2012). Ponadto, początkowo zaobserwowano, że rozszczepianie zarodka (podziały komórkowe) jest zablokowane (stadium dwukomórkowe u myszy i stadium ośmiokomórkowe u krowy), gdy warunki hodowli in vitro nie są optymalne. U myszy blokada rozwoju zarodka mijała po dodaniu do medium hodowlanego białka jajowodowego OVGP1 (Yong i in., 2002). Wiele badań eksperymentalnych wykazało, że jajowody różnych gatunków mają podobne właściwości biologiczne, co jest spójne z podobnymi profilami transkryptomicznymi i proteomicznymi (Mondéjar i in., 2012). Tak więc, jajowód danego gatunku może być wykorzystany do poprawy rozwoju zarodka innego gatunku, w procesie znanym jako test hetorologiczny. Bydlęce, mysie, królicze i owcze jajowody były używane do hodowli zarodków w heterologicznych lub homologicznych jajowodach in situ w celu uzyskania zarodków lepszej jakości od wielu gatunków (Rizos i in., 2002a, 2010a; Lazzari i in., 2010). Komunikacja pomiędzy jajowodem a zarodkiem jest precyzyjnie regulowana; na przykład, u bydła, in vivo rozwija się tylko jeden zarodek, podczas gdy in vitro hodowla zarodków w grupach jest konieczna dla uzyskania wyższego tempa rozwoju blastocyst (Goovaerts i in., 2009).

Perspektywy na przyszłość: Basic Science Will Improve the Efficiency of Assisted Reproductive Techniques

Można założyć, że skuteczność ART poprawi się tak szybko, jak szybko wzrośnie nasza wiedza na temat procesu in vivo. Nasza wiedza na temat środowiska in vitro opiera się w dużej mierze na próbach i błędach, a nie na dokładnej znajomości potrzeb gamet i zarodków; dlatego ART nieuchronnie zapewni suboptymalne środowisko, co spowoduje niezgodność repertuaru sygnałów biochemicznych. Wiedza na temat składników wydzielniczych jajowodu dostarczy informacji przydatnych do udoskonalenia różnych technik ART, co będzie miało istotne konsekwencje ekonomiczne i zdrowotne. W ten sposób niektóre protokoły zachowania gatunku obejmujące niepłodność i zachowanie genów zostaną nieuchronnie ulepszone. Rozwój ART nastąpił w różnym stopniu u różnych gatunków, wykazując, że proces zapłodnienia jest podobny, ale nie identyczny u wszystkich gatunków (Mondéjar i in., 2012; Van Soom i in., 2014), dlatego zaleca się przyszłe badania w różnych modelach zwierzęcych. Jajowód jest niezwykle ważny dla oocytów, plemników i zarodków. In vivo, jajowód przyczynia się do ochrony i dojrzewania plemników. Wiedza o tym, jak ten proces jest regulowany, pozwoli na ekstrapolację tych wyników do ulepszenia różnych rozcieńczalników nasienia (zwanych ekstenderami), które poprawiają żywotność i jakość plemników podczas przechowywania spermy, kriokonserwacji, sztucznej inseminacji, IVF i sex-sortingu. Poprzednie badania wykazały, że dodatek białek jajowodowych do rozcieńczalników nasienia poprawia zdolność do zapłodnienia i przeżywalność plemników sortowanych płciowo (Klinc i Rath, 2007; Lloyd i in., 2012). Szczegółowe badania biologii jajowodów przyczynią się do naszego zrozumienia dojrzewania oocytów w jajowodzie, dostarczając nowych narzędzi do poprawy przeżywalności i kompetencji mejozy, kontroli polispermii i penetracji plemników. Wreszcie, przedstawiamy dowody na znaczenie jajowodu dla rozwoju lepszych podłoży hodowlanych dla rozwoju zarodków i ich przeżycia po kriokonserwacji. Podsumowując, dziesięciolecia podstawowych badań naukowych związanych z fizjologią jajowodu dostarczyły ważnych informacji na temat zapłodnienia in vivo i pomogły osiągnąć cele, które niewielu mogło sobie wyobrazić. Jesteśmy przekonani, że w najbliższej przyszłości nowa wiedza generowana na temat efektu wytwarzanego przez jajowód w gametach i zarodkach poprawi wydajność ART, z oczywistymi korzyściami zdrowotnymi i ekonomicznymi.

Chcielibyśmy przeprosić za nieuwzględnienie wszystkich istotnych artykułów, które przyczyniły się do rozwoju tej dziedziny z powodu ograniczeń miejsca. Chcielibyśmy podziękować wszystkim członkom naszych laboratoriów za ich wkład naukowy w ciągu tych lat. Autorzy dziękują dr Alejandro Torrecillas i Omarowi Salvadorowi Acuña za przygotowanie rysunków 3 i 4, odpowiednio. Hiszpańskie Ministerstwo Gospodarki i Konkurencyjności oraz Komisja Europejska (FEDER/ERDF) wsparły badania D. Rizos (AGL2012-37510), P. Coy (AGL2012-40180-C03-01) i M. Avilés (AGL2012-40180-C03-02). M. Avilés jest również wspierany przez Fundación Séneca de la Región de Murcia (0452/GERM/06).

Manuel Avilés jest profesorem nadzwyczajnym w Katedrze Biologii Komórki i Histologii na Wydziale Medycyny i Pielęgniarstwa Uniwersytetu w Murcji (Hiszpania). Doktoryzował się w 1997 roku w Murcji, pracując nad pozakomórkowym płaszczem oocytu zwanym zona pellucida i jego zmianami po zapłodnieniu. Działalność naukową rozwijał na Queen’s University (Kingston, Kanada), Emory University (Atlanta, USA) i Lehigh University (Bethlehem, USA). Jego główne zainteresowania badawcze koncentrują się na molekularnych mechanizmach biorących udział w specyfice rozpoznawania pomiędzy plemnikiem a komórką jajową oraz na udziale jajowodu w dojrzewaniu gamet.

Dimitrios Rizos uzyskał tytuł doktora w 2002 roku na University College Dublin (Irlandia), a następnie pracował jako post-doc. W 2004 roku otrzymał 5-letnią pracę naukową w Departamencie Rozrodu Zwierząt (INIA, Madryt, Hiszpania), a od 2006 roku jest starszym badaczem i kierownikiem laboratorium Embriologii Preimplantacyjnej. Skupia się na wczesnym rozwoju embrionalnym in vivo i in vitro u ssaków oraz jakości zarodków, mechanizmach kontrolujących interakcje matka-zarodek, czynnikach odpowiedzialnych za niepłodność u krów mlecznych oraz strategiach mających na celu zmniejszenie strat embrionów i zwiększenie liczby ciąż. Opublikował ponad 70 wysoko ocenianych prac, ponad 100 abstraktów, kilka projektów badawczych i nawiązał międzynarodową współpracę.

Pilar Coy jest profesorem fizjologii rozrodu na Wydziale Weterynaryjnym Uniwersytetu w Murcji, Hiszpania. Doktoryzowała się w 1990 roku pracą na temat zapłodnienia in vitro u świń na Uniwersytecie w Murcji. Prowadziła badania przed- i podoktorskie na Uniwersytecie Bolońskim (Włochy), Uniwersytecie Kalifornijskim-Davis (USA), Instytucie Babraham w Cambridge (UK), Uniwersytecie Tennessee (USA) oraz Instytucie Zoologii (Londyn, UK). Jej główne cele badawcze koncentrują się na badaniu środowiska fizjologicznego w jajowodzie podczas zapłodnienia oraz na identyfikacji jajowodowych czynników wpływających na interakcję gamet.

Literatura cytowana