Abstract

Badaliśmy wpływ leczenia siarczanem wanadu (VOSO4) w dawce 5 i 10 mg/kg przez 30 dni na czynność endokrynną trzustki i histologię u szczurów bez cukrzycy i z cukrzycą indukowaną STZ. W grupie cukrzycowej poziom glukozy we krwi znacząco wzrósł, podczas gdy poziom insulinemii wyraźnie się obniżył. Pod koniec leczenia, VOSO4 w dawce 10 mg/Kg znormalizował poziom glukozy we krwi w grupie cukrzycowej, przywrócił insulinemię i znacznie poprawił wrażliwość na insulinę. VOSO4 zwiększył również w sposób zależny od dawki liczbę insuliny immunopozytywnych komórek beta w wysepkach trzustki szczurów bez cukrzycy. Ponadto, w grupie z cukrzycą STZ, spadek liczby insuliny immunopozytywnych komórek beta został skorygowany do osiągnięcia poziomu kontroli głównie z wyższą dawką wanadu. Dlatego leczenie VOSO4 normalizowało poziom glukozy i insuliny w osoczu oraz poprawiało wrażliwość na insulinę w cukrzycy eksperymentalnej STZ i indukowało proliferację i/lub regenerację komórek beta u szczurów normalnych lub z cukrzycą.

1. Wprowadzenie

Wanad jest metalem przejściowym. Szacuje się, że ponad 60 tys. ton tego pierwiastka jest emitowane do atmosfery każdego roku w wyniku działalności człowieka głównie ze spalania paliw kopalnych .

Po dostaniu się do układu krążenia przez przewód pokarmowy lub oddechowy związki wanadu są transportowane przez transferynę lub, rzadziej, przez albuminy lub niskocząsteczkowe składniki osocza, takie jak cytryniany i, w mniejszym stopniu, mleczany lub fosforany . Przeprowadzono wiele badań nad nieorganicznymi i organicznymi pochodnymi wanadu w modelach zwierzęcych z indukowaną cukrzycą, w których stwierdzono, że badane związki wpływają na poziom glukozy, cholesterolu i triglicerydów, bez znaczących szkodliwych skutków ubocznych przy długotrwałym podawaniu. Wiele eksperymentów przeprowadzono również u pacjentów z cukrzycą, potwierdzając terapeutyczny wpływ związków wanadu na poziom glukozy we krwi przy niewielkim działaniu toksycznym. Wykazano, że wanad (w tym wanadyl i wanadan) obniża poziom glukozy we krwi poprzez stymulację glikogenezy, wychwytu glukozy i metabolizmu oraz poprzez hamowanie powstawania glukozy na drodze wątrobowej glukoneogenezy i glikogenolizy. Stwierdzono, że wanad i związki wanadu wykazują aktywność insulinopodobną poprzez naśladowanie działania insuliny za pośrednictwem aktywacji kinazy tyrozynowej receptora insulinowego i szlaków kaskady fosforylacji kinaz. Dlatego też siarczan wanadylu został zasugerowany jako środek terapeutyczny w leczeniu cukrzycy typu 1. Leczenie streptozotocyną (STZ) niszczy komórki beta trzustki produkujące insulinę, a wywołana STZ cukrzyca u szczurów jest uważana za model cukrzycy typu 1. Chociaż wykazano, że związki wanadu mają właściwości przeciwcukrzycowe w modelu cukrzycy indukowanej STZ, mechanizm ich działania pozostaje obecnie przedmiotem badań. Celem tego badania było zbadanie odpowiedzi na 30-dniowe leczenie siarczanem wanadu u szczurów z cukrzycą i bez cukrzycy indukowanej STZ.

2. Materiały i metody

2.1. Przygotowanie szczurów z cukrzycą

Zwierzęta stały się cukrzykami poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie (ip) STZ w pojedynczej dawce 65 mg/Kg w 0,01 M buforze cytrynianowym (pH 4,5). Ta metoda ip została wybrana na podstawie ostatnich doniesień, które wykazały wyraźny efekt zwiększający stężenie glukozy u szczurów z cukrzycą STZ .

2.2. Zwierzęta i leczenie

Męskie szczury Wistar, 5-6-tygodniowe (ważące 175-200 g), zostały zakupione od Pasteur Institute of Tunisia i użyte zgodnie z Lokalną Komisją Etyczną Uniwersytetu w Tunisie do wykorzystania i opieki nad zwierzętami zgodnie z zaleceniami NIH. Dostarczano im pokarm (standardowa dieta granulowana-Badr Utique-TN) i wodę ad libitum oraz trzymano po pięć sztuk w klatce w temperaturze pokojowej (22°C) z 12-godzinnym cyklem światło-ciemność. Szczury zostały podzielone na sześć grup.

Grupa 1 to zwierzęta kontrolne bez cukrzycy (kontrola ND) i otrzymywały codziennie dootrzewnową iniekcję (ip) NaCl 9. Grupy 2 i 3 były ND i otrzymywały codziennie dawkę albo 5 lub 10 mg VOSO4/Kg, odpowiednio (ND + 5 mg/Kg i ND + 10 mg/Kg), przez 30 dni. Grupa 4 stanowiła kontrolę cukrzycową (D control), której wstrzyknięto pojedynczą dawkę 65 mg/Kg STZ. Grupy 5 i 6 stanowiły zwierzęta z cukrzycą STZ, którym podawano VOSO4 w dawce 5 lub 10 mg/Kg przez 30 dni (D + 5 mg/Kg, D + 10 mg/Kg). Grupy STZ były leczone VOSO4 po 48 godzinach od wystąpienia cukrzycy wywołanej STZ.

2.3. Biochemical Assays

Wszystkie zwierzęta były na czczo 12 godzin przed oznaczeniem glikemii za pomocą glukometru (ACCU-CHEK-Active Roche). Wrażliwość na insulinę mierzono po wstrzyknięciu ip 1 U/Kg insuliny, a poziom glukozy we krwi oznaczano w odstępach 30-minutowych w ciągu 2 godzin jako procent poziomu hormonu w .

Zwierzęta uśmiercono po 24 godzinach od ostatniego leczenia, a krew pobrano i surowicę przetworzono do oceny insuliny, którą oznaczono za pomocą zestawu Elisa (rozprowadzanego przez BioVendor).

2.4. Ocena immunohistochemiczna

Wybarwianie immunohistochemiczne insuliny przeprowadzono w celu scharakteryzowania integralności komórek beta w wysepkach Langerhansa. W tym celu do porównań między grupami wybrano wycinki tkanki przedstawiające maksymalnie większą powierzchnię wysepek Langerhansa. Sekcje zostały najpierw odparafinowane, uwodnione poprzez malejącą stopniową serię etanolową, zanurzone w tamponie cytrynianowym (pH 6) na 40 min, a następnie inkubowane z poliklonalnym przeciwciałem antyinsulinowym Guinea Pig rozcieńczonym w 50 mM Tris-HCl, pH 7,6 (DAKO). Po płukaniu, skrawki inkubowano z przeciwciałem przeciw śwince morskiej sprzężonym z fosfatazą, a procedura odsłaniania była wspomagana przez aparat TechMate 500. Na koniec sekcje barwiono hematoksyliną/eozyną.

Dziesięć wysepek trzustkowych na szczura badano pod mikroskopem i liczono liczbę komórek insulino-dodatnich i insulino-ujemnych, numerując ich jądra. Dane wyrażono jako procent komórek immunopozytywnych na insulinę/całkowitą liczbę komórek w każdym wysepku.

2.5. Analiza statystyczna

Nieistotność różnic między różnymi grupami oceniano za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu porównań wielokrotnych Tukeya, a wartość przyjmowano jako istotną na poziomie.

3. Wyniki

Wpływ leczenia VOSO4 na poziom glukozy we krwi u szczurów niecukrzycowych (ND) i cukrzycowych (D) przedstawiono na rycinie 1. Nie było istotnych zmian w poziomie glukozy we krwi w grupie kontrolnej ND podczas leczenia (Rysunek 1(a)). Leczenie szczurów ND preparatem VOSO4 w dawce 5 lub 10 mg/Kg nie zmieniło istotnie poziomu glukozy we krwi w ciągu pierwszych 10 dni. Jednak poziom glukozy we krwi zmniejszył się znacząco pod koniec leczenia dawką 5 mg/Kg i był znacząco zmniejszony od 15 do 30 dnia z dawką 10 mg/Kg w porównaniu do grupy kontrolnej ND. W 30 dniu, spadek glikemii wynosił około 8 i 15%, odpowiednio, dla dawek 5 i 10 mg/Kg w porównaniu z grupą kontrolną. Jak podejrzewano, zauważalny wzrost poziomu glukozy we krwi był obserwowany u szczurów kontrolnych leczonych STZ w porównaniu do zwierząt nieleczonych (versus mg/dL) wskazując na instalację cukrzycy, która była utrzymywana podczas całego eksperymentu. Leczenie grupy cukrzycowej (D) dawką 5 mg/Kg VOSO4 obniżyło znacząco poziom glukozy we krwi od dnia 10, podczas gdy dawka 10 mg/Kg obniżyła poziom glukozy we krwi znacząco i stopniowo od dnia 5 do osiągnięcia normalnego poziomu w dniu 30. Odnotowane wartości glikemii w 30 dniu wynosiły i versus mg/dL, odpowiednio, w grupach D + 5, D + 10 i kontrolnej D (rysunek 1(b)).

Tabela 1 pokazała poziomy insuliny w grupach ND i D bez i po leczeniu VOSO4. U szczurów ND leczonych VOSO4 w dawce 5 mg/Kg nie stwierdzono istotnych zmian w poziomie insulinemii, natomiast wyraźny wzrost uzyskano przy dawce 10 mg/Kg w porównaniu z grupą kontrolną ND ( versus µg/L). Ponadto, w grupie kontrolnej D, insulinemia uległa głębokiemu obniżeniu w porównaniu z grupą kontrolną ND ( versus µg/L). Podanie VOSO4 w grupie D wyraźnie zwiększyło insulinemię w sposób zależny od dawki. W rzeczywistości poziom insuliny był zwiększony u szczurów z cukrzycą z do i µg/L z, odpowiednio, dawkami 5 mg i 10 mg/Kg.

Zmiany wrażliwości na insulinę po wstrzyknięciu ip insuliny (1 U/Kg) u normalnych i leczonych cukrzycą zwierząt przedstawiono na rycinie 2. U szczurów ND, leczenie 10 lub 5 mg VOSO4 nie zmieniło profilu glikemii w odpowiedzi na podanie insuliny (Figura 2(a)). W tych grupach maksymalny efekt hipoglikemizujący insuliny obserwowano odpowiednio po 60 i 90 min i wynosił on około wartości glikemii wyjściowej. Zwierzęta chore na cukrzycę leczone małą dawką VOSO4 wykazywały podobny profil glikemii jak grupa kontrolna D z maksymalnym spadkiem do 60 min, podczas gdy zwierzęta leczone dużą dawką wykazywały znaczący () i szybki maksymalny spadek glikemii do 30 min po wstrzyknięciu insuliny (ryc. 2(b)).

W grupach leczonych VOSO4 zaobserwowano większy rozmiar wysepek trzustkowych w porównaniu z odpowiednimi grupami kontrolnymi ND i D (ryc. 3 i 4). Analizy statystyczne wykazały, że leczenie VOSO4 indukowało wyraźny wzrost liczby komórek immunopozytywnych na insulinę o około 20% w grupie ND + 5 i 27% w grupie ND + 10 mg/Kg (ryc. 5). Leczenie VOSO4 znacznie zwiększyło liczbę komórek immunopozytywnych na insulinę w grupach STZ-diabetyków w sposób zależny od dawki o 12 i 23%, odpowiednio, z dawkami 5 i 10 mg / kg (Figura 5). Porównanie pomiędzy grupami leczonymi STZ-diabetykami i szczurami kontrolnymi ND nie wykazało istotnych różnic.

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Rycina 5

Wpływ siarczanu wanadylu na liczbę komórek beta w %. Wartości przedstawiają średnie ± SD. ; versus ND control. ; versus D control. versus D + 5 mg/Kg. Analizie poddano 10 wysepek na szczura.

4. Dyskusja

Badaliśmy właściwości przeciwcukrzycowe wanadu, badając jego wpływ na poziom glukozy i insuliny we krwi, a także na komórki B trzustki endokrynnej.

Nasze badanie wykazało również, że efektowi hipoglikemizującemu VOSO4 towarzyszył wyraźny wzrost podstawowego poziomu insulinemii w grupie chorych na cukrzycę w sposób zależny od dawki. Z dawką 10 mg, poziom insulinemii u szczurów z cukrzycą został prawie znormalizowany. Rzeczywiście, spadek poziomu glukozy we krwi zarejestrowany szczególnie u szczurów z cukrzycą narażonych na działanie związku wanadu może być związany z jednoczesnym wzrostem stężenia insuliny w osoczu. Wyniki te były zgodne z wcześniejszymi danymi dotyczącymi skuteczności związków wanadu w poprawie stanu cukrzycy .

Ponadto, zbadaliśmy wpływ podawania wanadu na wrażliwość na insulinę u szczurów z cukrzycą i bez cukrzycy. W grupach ND, wykazaliśmy maksymalny efekt hipoglikemiczny insuliny w 60-90 min po wprowadzeniu hormonu. Natomiast w grupach D leczenie VOSO4 w dawce 10 mg zwiększyło wrażliwość na insulinę, powodując szybszy i wyraźniejszy spadek stężenia glukozy we krwi po podaniu hormonu, podczas gdy dawka 5 mg nie zmieniła istotnie odpowiedzi glikemii u szczurów D. Poprawa wrażliwości na insulinę wywołana przez VOSO4 jest zgodna z licznymi badaniami wskazującymi, że wanad może być uważany za silny mimetyk insuliny lub trofikę insuliny w różnych tkankach .

Wykazano, że związki wanadu charakteryzują się wieloma sposobami działania powodującymi obniżenie poziomu cukru we krwi. Badania in vivo i in vitro wykazały, że siarczan wanadylu zwiększał transport i metabolizm glukozy w mięśniach szkieletowych, wątrobie i tkance tłuszczowej. Organiczne pochodne wanadu, dzięki strukturalnemu podobieństwu do anionów ortofosforanowych, hamują fosfatazę białkową fosfotyrozynową. Hamują również aktywność PTP-1B, enzymu odpowiedzialnego za deprofosforylację receptora insulinowego, powodującego insulinooporność. Innym mechanizmem obniżania stężenia glukozy we krwi przez związki wanadu jest aktywacja kinazy PKB/Akt prowadząca do zwiększenia wychwytu glukozy przez transporter GLUT4. Aktywacja PKB/Akt stymuluje również fosforylację GSK3, co skutkuje pobudzeniem syntezy glikogenu. Z drugiej strony stwierdzono, że hamowanie kinazy C-jun N-końcowej poprawia wrażliwość na insulinę w cukrzycy doświadczalnej .

Wanad zwiększa transport glukozy i oksydację oraz aktywność kinazy tyrozynowej receptora insulinowego i wywiera insulinopodobny wpływ na metabolizm glukozy i lipidów przez szlaki biochemiczne zależne lub niezależne od insuliny .

Wiadomo, że leczenie STZ niszczy komórki beta wysepek trzustkowych indukując cukrzycę insulinozależną. Tak więc w obecnym badaniu wykazaliśmy zmniejszenie powierzchni wysepek trzustkowych związane z wyraźnym zmniejszeniem liczby immunoreaktywnych komórek beta dla insuliny w grupie cukrzycowej w porównaniu z niediabetycznymi zwierzętami kontrolnymi. Jednakże, w obu grupach ND i D, leczenie VOSO4 powiększyło rozmiar wysepek trzustkowych w porównaniu z odpowiednimi grupami kontrolnymi. Co najważniejsze, leczenie VOSO4 u szczurów z cukrzycą zwiększyło w sposób zależny od dawki liczbę immunopozytywnych komórek beta w porównaniu z grupą nieleczoną, co sugeruje, że VOSO4 może generować komórki beta u szczurów z cukrzycą indukowaną STZ. W rzeczywistości liczba komórek beta w wysepkach szczurów z cukrzycą, którym podawano VOSO4 w dawkach 5 i 10 mg, nie różniła się istotnie od liczby komórek beta w grupie ND. Jest to zgodne z wcześniejszymi badaniami dotyczącymi właściwości insulinotropowych tego związku w trzustce. Co ciekawe, leczenie wanadem zwiększało również istotnie liczbę komórek beta w wysepkach szczurów bez cukrzycy.

W mysim modelu trzustki alloxan-perfused segment, Waguri i wsp. donieśli o procesach regeneracji komórek beta z pozawysepkowych komórek prekursorowych. Rzeczywiście, u szczurów z cukrzycą STZ, leczenie VOSO4 może stymulować proliferację komórek beta z wewnątrzwsiatkowych komórek endokrynnych i różnicowanie z pozawsiatkowych komórek prekursorowych.

W podsumowaniu, obecne badanie pokazuje, że siarczan wanadylu może być użyteczny jako potencjalny środek przeciwcukrzycowy. Jednakże, ponieważ obecne dowody są nadal ograniczone i oparte głównie na modelach zwierzęcych oraz niewiele wiadomo na temat postaci terapeutycznych i działań niepożądanych związków wanadu, konieczne są dalsze badania nad ich długoterminowym stosowaniem jako konwencjonalnej terapii u pacjentów z cukrzycą.

Konflikt interesów

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów w związku z publikacją tej pracy.

Podziękowania

Praca ta była wspierana przez tunezyjskie Ministerstwo Szkolnictwa Wyższego i Badań Naukowych.