3.53.4.3 Synthetic Phage Therapy
Bacteriophage, ou simplesmente chamado de fago, tem desempenhado um papel central no desenvolvimento da biologia molecular, genética bacteriana e fornecendo as primeiras ferramentas para recombinação de moléculas de DNA, tais como enzimas de restrição e ligases. Na última década, o estudo dos mecnaismos de resistência a fago levou à descoberta de uma das mais importantes tecnologias capacitadoras da SB desde a PCR; ou seja, os sistemas de nuclease CRISPR, que as bactérias e arcaias evoluíram como uma defesa adaptativa ao DNA exógeno. A recente identificação de inúmeros outros sistemas anti-fágicos anteriormente não caracterizados pode fornecer novas tecnologias inovadoras para aplicações da SB.45 Neste contexto histórico, é apropriado então que a SB seja agora aplicada ao fago para aperfeiçoar seu uso como agentes terapêuticos.
Phage foi descoberta independentemente por Frederik Twort e Félix D’Hérelle no início do século 2046,47 e logo depois perseguida como agente antimicrobiano para tratar doenças infecciosas como cólera e peste. Na Europa Oriental, a fago terapia tornou-se um lugar comum e existem até hoje vários centros de tratamento de renome, por exemplo, na Geórgia e na Polónia. No Ocidente, após alguns sucessos iniciais esporádicos, a fagoterapia desvaneceu-se com o uso de antibióticos, tornando-se amplamente disponível. Hoje com o aumento de patógenos resistentes a antimicrobianos, inicialmente as chamadas cepas ESKAPE48 , mas agora um conjunto ainda mais amplo de patógenos49 que se prevê que resultarão em mais mortes do que o câncer até 2050, há um interesse renovado na terapia de fagos.
O uso de fagos tem várias vantagens sobre os antibióticos, principalmente o potencial de visar cepas específicas e assim deixar intacta a comunidade microbiana benéfica, e também a capacidade de superar a resistência através do uso de coquetéis complementares de fagos, ‘treinamento’ de fagos em cepas hospedeiras selecionadas ou simplesmente isolando novos fagos contra um patógeno. Por outro lado, existem vários obstáculos a superar e áreas a melhorar para que a terapia com fagos se torne um medicamento confiável e amplamente adotado no Ocidente, tais como: fortes testes clínicos com controles adequados, reduzindo o tempo para identificar fagos com a faixa de hospedeiro apropriada, superando mecansims de resistência e exclusão de fagos da linhagem alvo sem a necessidade de coquetéis complexos, contornando respostas imunes indesejadas às partículas de fagos e contenção da transdução generalizada de genes de resistência a antibióticos ou fatores de virulência bacteriana. Mesmo no caso da morte bem sucedida de uma cepa alvo, a lise rápida de um grande número de bactérias e a concomitante liberação de endotoxinas e superantigénios pode resultar numa resposta infamatória forte e num resultado clínico desfavorável.
A organização altamente modular dos genomas dos fagos e a montagem da estrutura do fago como módulos funcionais, tais como fibras da cauda, espigões, tubos da cauda e capsidos, torna os fagos alvos ideais para abordagens de SB, num sentido em que os genomas dos fagos já estão organizados em BioBricks. Em um modelo inicial para o futuro projeto do fago sintético o fago filamentoso Pf3 foi modificado para tratar a infecção por Pseudomonas aeruginosa em um modelo de rato.50 Um gene de proteína de exportação do Pf3 foi substituído por um gene que codifica a endonuclease de restrição BglII, com o raciocínio de que (1) esta substituição do gene torna o Pf3 não-replicativo, introduzindo assim uma estratégia de contenção, (2) o fago pode ser estavelmente propagado em um hospedeiro contendo o gene da metilase BglII e (3) o BglII catalisaria a dupla quebra de cordão no DNA genômico da estirpe alvo para matar. Uma descoberta importante deste estudo foi que o tratamento de ratos infectados com o fago artificial Pf3R ou com um fago lítico deu uma capacidade de sobrevivência comparável para ratos desafiados com uma dose mínima letal de 3, mas com uma dose mínima letal de 5, a taxa de sobrevivência foi significativamente melhor com a terapia de fago Pf3R. A análise dos níveis séricos de citocinas indicou uma resposta inflamatória reduzida indicando que o melhor resultado para o grupo de tratamento com Pf3R é devido ao abate eficiente da estirpe alvo sem lise e libertação de endotoxinas.
O abate de P. aeruginosa pelo Pf3R depende da gama de hospedeiros do fago para fornecer a especificidade do alvo, uma vez que seria de esperar que os locais de restrição de BglII estivessem presentes em essencialmente todos os genomas bacterianos. Uma melhoria é sugerida pela notável descoberta de um bacteriófago que obteve um sistema CRISPR/Cas, de uma fonte desconhecida, para seu próprio uso.51 O sistema CRISPR/Cas codificado por fago é capaz de adquirir novos espaçadores e o nuclease CAS3 foi redirecionado para um elemento cromossômico que seu hospedeiro, Vibrio cholera, usa para imunidade inata. Após essa descoberta, o sistema CRISPR Tipo II de Streptococcus pyogenes foi modificado em bacteriófagos M13 com espaçadores para alvejar seqüências de resistência a antibióticos e genes de virulência em Escherichia coli, os autores se referindo a esses dispositivos como nucleases guiadas por RNA (RGNs).52 Demonstrando a especificidade requintada desse sistema, um RGN foi capaz de matar discriminadamente uma cepa que abriga um único polimorfismo de nucleotídeos na giroses do DNA que confere resistência a quinolonas. Além disso, num consórcio artificial de três estirpes bacterianas foram capazes de matar estirpes seleccionadas (400-20.000 mortes por dobra em comparação com os controlos), deixando os outros membros do consórcio intactos. A especificidade do CRISPR/Cas-mediated killing poderia expandir a terapia de fago para além da focalização em patógenos, para uma modulação precisa dos microbiomas humanos, cuja composição tem sido implicada no prognóstico de alguns cancros e até de distúrbios neurológicos como o autismo, Parkinsons e Alzheimers através do eixo intestinal-cérebro.
Uma plataforma ideal de fago sintético poderia ser uma plataforma em que a ligação do hospedeiro é projetada para ser muito ampla, enquanto a especificidade da focalização da estirpe é fornecida pela carga útil do CRISPR/Cas. Desta forma, a fago poderia ser facilmente implantada para tratamentos, sem que uma nova plataforma tivesse que ser isolada ad hoc para cada patógeno. Além disso, a ampla gama de hospedeiros combinados com matrizes CRISPR visando vários genes de resistência a antibióticos ou virulência poderia permitir o uso de uma suposta terapia de fago, isto é, antes da identificação do patógeno. As estratégias de extensão da gama de hospedeiros incluem telas genéticas para identificar receptores de fago e fatores hospedeiros necessários,53 mineração de seqüências de proteína de ligação do receptor do profago (RBP) a partir de genomas de bactérias e reinicialização de fago sintético que poderia, por exemplo, codificar bibliotecas de proteína de ligação do receptor RBP para HTS.54,55 O mascaramento de receptores por cápsulas pode ser superado pela expressão de enzimas exopolissacarídeos hidrolisantes56 e outras enzimas para degradar biofilmes57 enquanto outros mecanismos de mascaramento e variação de fase na expressão do receptor podem ser superados por fago projetado com várias fibras de cauda contendo diferentes RBPs ou RBPs para alvos não-canônicos de superfície celular altamente conservados. As bactérias utilizam inúmeros sistemas anti-phage, sendo os principais a imunidade inata da modificação de restrição e a imunidade adaptativa do CRISPR/CAS, mas, inversamente, têm múltiplas estratégias contra-evolvidas para derrotar esses sistemas, como o uso de nucleotídeos não-canônicos em seu DNA, ter menos locais de restrição ou hipermetilar seus genomas e fornecer proteínas que inibem as enzimas de restrição ou aumentam as enzimas metilantes do hospedeiro.
A plataforma de fago sintético aqui descrita evitaria a necessidade de coquetéis de fago para os quais a aprovação regulatória pode ser mais complexa. Os restantes alvos da engenharia do fago são genéricos para muitos biólogos, tais como a estabilidade e resposta do sistema imunológico. As células fágicas, em particular, são responsáveis pela remoção de partículas de fago do sistema circulatório. Os fagos mutantes de circulação longa foram obtidos por uma técnica de passagem em série58 e foram encontrados mutantes na proteína capsidar principal. Mais tarde, uma única mudança de aminoácidos, também em uma proteína capsid, introduzida por manipulação genética direta, resultou em um aumento de 13.000 a 16.000 vezes na capacidade do fago de permanecer no sistema circulatório do rato.59 Outros parâmetros para melhorar o fago como agente terapêutico, tais como produção, formulação e via de administração provavelmente estão fora do escopo das atividades da SB, mas as lições aprendidas no trabalho anterior com fagos nativos também se aplicarão aos fagos artificiais da SB.
Na última década, com o interesse renovado na terapia com fagos e os relatos esporádicos de casos individuais bem sucedidos de pacientes, houve tentativas de realizar ensaios clínicos controlados que não resultaram em efeitos adversos significativos, mas a eficácia ainda não foi enfaticamente demonstrada. Será um próximo artigo excitante da história da terapia com fagos, que começou há mais de 100 anos, para ver os fagos artificiais da SB entrarem em ensaios clínicos.